毛穎穎　汪洪波　劉海平

摘要：目的：選取低氧反應(yīng)基因——誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）基因序列上rs10459953、rs1060822單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點(diǎn)，研究其與低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)關(guān)聯(lián)性。方法：采用關(guān)聯(lián)研究方法（Association-Study），聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）實(shí)驗(yàn)解析技術(shù)，選取35名健康受試者在模擬海拔2500 m高度進(jìn)行4 周高住-高練-低訓(xùn)（living high-exercise high-training low， Hi-Hi-Lo）。研究iNOS基因SNP rs10459953和SNPrs1060822與低氧訓(xùn)練后最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、血紅蛋白（hemoglobin， Hb）、紅細(xì)胞數(shù)（red blood cell， RBC）等生理表型指標(biāo)關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：1）4周低氧訓(xùn)練后，SNP rs10459953不同基因型之間VO2max 、Hb、RBC變化量均無(wú)顯著性差異。2）4 周低氧訓(xùn)練后，SNP rs1060822不同基因型間Hb、RBC變化量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中CT 基因型受試者Hb、RBC顯著增加（P<0.05），且在低氧環(huán)境下定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓(xùn)練后期SpO2動(dòng)態(tài)曲線顯著高于初期（P<0.05）。結(jié)論：iNOS基因 SNP rs1060822與低氧訓(xùn)練后血象指標(biāo)存在一定關(guān)聯(lián)性，CT基因型表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；單核苷酸多態(tài)性；低氧訓(xùn)練

中圖分類號(hào)：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-2076（2014）01-0085-05

低氧訓(xùn)練能提高耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員的有氧運(yùn)動(dòng)能力，這已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所認(rèn)同。但由于個(gè)體對(duì)低氧生理反應(yīng)的差異性，會(huì)產(chǎn)生不同的低氧訓(xùn)練適應(yīng)效果[1]，且低氧訓(xùn)練效果差異性與遺傳學(xué)因素有關(guān)。Pasha 等證實(shí)，高原病的易感率以及人類對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力與相關(guān)低氧反應(yīng)基因多態(tài)性有關(guān)[2-3]。

山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)第30卷第1期2014年2月 毛穎穎，等iNOS基因rs10459953/rs1060822多態(tài)性與低氧訓(xùn)練效果的關(guān)聯(lián)性研究No.1 2014 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase ， NOS）在體內(nèi)的主要生物學(xué)作用是催化L2精氨酸氧化生成一氧化氮（nitric oxide ， NO），NO是一種可在細(xì)胞間自由擴(kuò)散的信使分子，參與心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。大量研究證實(shí)，NOS活性增強(qiáng)，促進(jìn)生成的NO可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至骨骼肌，改善運(yùn)動(dòng)肌內(nèi)血流量[4-5]。此外，iNOS基因啟動(dòng)子上有一段與低氧反應(yīng)增強(qiáng)子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，因此，iNOS表達(dá)可對(duì)細(xì)胞感受低氧調(diào)節(jié)發(fā)揮一定作用[6]。因此，iNOS基因多態(tài)性可能與低氧訓(xùn)練適應(yīng)遺傳因素有關(guān)。

本研究選取iNOS基因5端非編碼區(qū)的SNP rs10459953和第20外顯子2622bp處的SNP rs1060822 兩位點(diǎn)，研究其與低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，以探尋低氧訓(xùn)練個(gè)體差異性的遺傳學(xué)標(biāo)記。

1對(duì)象與方法

1.1受試對(duì)象

本研究選取35名健康受試者（男性23名，女性12名），平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg，均系中國(guó)北方漢族健康人群，無(wú)低氧暴露經(jīng)歷。

1.2低氧運(yùn)動(dòng)方案

受試者居住于常壓低氧環(huán)境，每天晚上20：00至次晨6：30在氧濃度為15.4%低氧房?jī)?nèi)（相當(dāng)于海拔2500 m）休息和睡眠，低氧暴露時(shí)間≥10 h/天，白天在海拔50 m的常氧環(huán)境下學(xué)習(xí)生活，共進(jìn)行4周實(shí)驗(yàn)。低氧實(shí)驗(yàn)期間，進(jìn)行每周3次，每次30分鐘的蹬功率自行車低氧定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，以基礎(chǔ)VO2max70%強(qiáng)度為運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，功率自行車轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分。

1.3測(cè)試方案

1.3.1生理指標(biāo)測(cè)試

生理指標(biāo)測(cè)試：低氧實(shí)驗(yàn)前后分別進(jìn)行1次最大攝氧量（maximal oxygen uptake， VO2max）、血象指標(biāo)（hematological parameters）、低氧定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)下血氧飽和度（oxygen saturation， SpO2）的測(cè)試。VO2max測(cè)試采用遞增負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，起始負(fù)荷60 W，功率車轉(zhuǎn)速為60 RPM，每3分鐘遞增30 W，直至力竭，VO2max判定標(biāo)準(zhǔn)以心率超過(guò)180 b/min，呼吸商超過(guò)1.1，VO2不再增加，受試者不能保持蹬車頻率等因素綜合確定；血象指標(biāo)測(cè)試是受試者晨空腹取靜脈血0.5 ml，采用BECKMAN STKS型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行測(cè)試分析，主要包括紅細(xì)胞（RBC）、血細(xì)胞壓積（Hct）、血紅蛋白（Hb）等；SpO2采用定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，即受試者在15.4%O2低氧環(huán)境下，以70%基礎(chǔ)VO2max強(qiáng)度進(jìn)行蹬功率自行車，功率自行車轉(zhuǎn)速為60 RPM，持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間21min，記錄安靜時(shí)、運(yùn)動(dòng)中每3min及恢復(fù)期間1min、3min的SpO2。

1.3.2基因多態(tài)性分析

取靜脈血2 ml，2% EDTA抗凝，用promega公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA，對(duì)iNOS基因SNP rs10459953及rs1060822進(jìn)行分析。

1.3.2.1iNOS基因SNP rs10459953分析 依據(jù)人類iNOS基因序列，用Primer 5. 0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--GGAAGAAACAAAACCCTCT-3-；下游引物：5--CCTGGCAGTCACAGTCATA-3-。20 μLPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，包括：10×PCR 2 μL， 25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶1 U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產(chǎn)品。

擴(kuò)增方案是：1）94°C預(yù)變性5 min；2）94 °C變性40 s，54 °C退火40 s，72°C延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；3）72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為405 bp 片段。限制性內(nèi)切酶分析：EagI 在37°C 1 h消化擴(kuò)增產(chǎn)物，3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide， EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像（上海天能）。

1.3.2.2iNOS基因SNP rs1060822分析 依據(jù)人類iNOS基因序列，用Primer 5. 0設(shè)計(jì)引物， 引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--AAATGAAAGGAGGGCACA-3-；下游引物：5--CACCACTCGCTCCAGTAT-3-。20 μLPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，包括：10×PCR Buffer 2 μL，25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10 mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶2 U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產(chǎn)品。

擴(kuò)增方案是：1）94°C預(yù)變性5 min；2）94℃變性40 s，52℃退火40 s，72°C延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；3）72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為232 bp 片段。限制性內(nèi)切酶分析：AccI 在37°C 1h消化擴(kuò)增產(chǎn)物，3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide， EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像（上海天能）。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以±SD表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)包（SPSS software for Windows 11.5 package）完成。受試者人群的基因型頻率是否符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律采用卡方檢驗(yàn)（chi-test）統(tǒng)計(jì)；低氧訓(xùn)練前后生理指標(biāo)數(shù)據(jù)先用K-S檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，如符合進(jìn)行下面統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：低氧訓(xùn)練前、后基因型之間的生理指標(biāo)差異用單因素分析（ANOVA）處理，當(dāng)基因型只有兩種時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理，組間的兩兩比較采用Post-Hoc處理；基因型之間生理指標(biāo)的變化量采用協(xié)方差處理，以低氧訓(xùn)練前的初始值作為協(xié)變量進(jìn)行分析，分析不同基因型受試者進(jìn)行定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)時(shí)SpO2的變化差異，采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差處理（基因型X時(shí)間），基因型組同一時(shí)間點(diǎn)SpO2的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理。顯著水平設(shè)為P<0.05。

2結(jié)果

2.1iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822分析結(jié)果

35名受試者iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822解析結(jié)果顯示，SNP rs10459953位點(diǎn)中，GG基因型頻率占31%，GC基因型頻率占49%，CC基因型頻率占20%，G等位基因頻率為44%，C等位基因頻率為56%。SNP rs1060822位點(diǎn)中，CC基因型頻率占11%，CT基因型頻率占83%，TT基因型頻率占6%，C等位基因頻率為53%，T等位基因頻率為47%?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明，SNP rs10459953基因型頻率符合Hardy-weinberg遺傳平衡，而SNP rs1060822位點(diǎn)不符合Hardy-weinberg遺傳平衡，可能是由于樣本量過(guò)少（圖1）。

2.2iNOS基因SNP rs10459953與低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)的關(guān)聯(lián)變化

低氧訓(xùn)練前后，測(cè)試所有35名受試者VO2max、Hb、RBC 等生理生化指標(biāo)，結(jié)果顯示，低氧訓(xùn)練前，SNP rs10459953不同基因型之間最大攝氧量的絕對(duì)值存在顯著性差異（P<0.05），組間兩兩比較結(jié)果顯示，GC基因型明顯高于GG基因型（3594.07±295.11 vs 3102.31±499.84 ml/min，P=0.002）；GC基因型與CC基因型相比無(wú)顯著性差異；低氧訓(xùn)練后，各基因型組間VO2max、Hb、RBC變化均未顯現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3iNOS基因SNP rs1060822與低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)的關(guān)聯(lián)變化

SNP rs1060822不同基因型實(shí)驗(yàn)前后生理指標(biāo)變化結(jié)果見(jiàn)表2。低氧訓(xùn)練前各基因型組間VO2max、Hb、RBC 等生理表型指標(biāo)無(wú)明顯變化。低氧訓(xùn)練后，SNP rs1060822各基因型組間ΔHb、ΔRBC存在顯著性差異（P<0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CT基因型Hb增加幅度明顯高于CC基因型（1.70±6.63 vs -12.36±5.85 g/L，P<0.05）；ΔRBC的組間兩兩比較結(jié)果顯示，CT基因型增加幅度明顯高于CC基因型（0.25±0.41 vs -0.28±0.32×1012/L，P<0.05）；CT基因型群體ΔHb、ΔRBC與TT基因型群體相比差異無(wú)顯著性，但從升高幅度的趨勢(shì)上分析，CT基因型相比具有一定優(yōu)勢(shì)。表2iNOS基因SNP rs1060822 C/T低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)變化±SD

2.4低氧定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中SpO2指標(biāo)的變化

低氧訓(xùn)練前后，低氧環(huán)境下定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程SpO2動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見(jiàn)圖2，SNP rs10459953的GG和GC基因型受試者低氧訓(xùn)練前后SpO2變化存在顯著性差異（P<0.05），后期定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中GG和GC型受試者SpO2動(dòng)態(tài)曲線處于較高水平；SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓(xùn)練前后SpO2動(dòng)態(tài)曲線變化存在顯著性差異（P<0.05），后期定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SpO2動(dòng)態(tài)曲線顯著高于初期。

圖2iNOS基因SNP rs10459953 和SNP rs1060822多態(tài)位點(diǎn)不同基因型受試者低氧訓(xùn)練前后定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)期間SpO2動(dòng)態(tài)變化曲線

3討論

NO 是體內(nèi)的一種氣體信號(hào)分子，它對(duì)于血管舒張，促進(jìn)血液循環(huán)有明顯作用[7]，且可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的功能，同時(shí)也參與低氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)某些低氧敏感基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[8]。iNOS是體內(nèi)合成NO關(guān)鍵限速酶，在血管內(nèi)皮局部受到損傷時(shí)，iNOS在嚴(yán)格控制下的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)于補(bǔ)償內(nèi)源性NO不足、恢復(fù)正常血管功能具有重要意義[9]。近年來(lái)，關(guān)于iNOS基因多態(tài)性研究多集中于臨床疾病方面，與低氧訓(xùn)練、低氧適應(yīng)效果個(gè)體差異性的研究甚少。

人體iNOS 基因位于第17 號(hào)染色體長(zhǎng)臂（17q11.2～17q12），全長(zhǎng)約37kb，含有26 個(gè)外顯子。本研究選取的SNP rs10459953位于iNOS基因5端非編碼區(qū)，該區(qū)域?yàn)橐欢芜B接第一外顯子和啟動(dòng)子的非編碼序列，雖不能編碼蛋白質(zhì)，但對(duì)于遺傳信息的表達(dá)是必不可少，在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用，如①保護(hù)mRNA，防止RNA酶5-3端外切酶活性對(duì)mRNA的講解；②增強(qiáng)mRNA的剪切和翻譯效率；③影響翻譯起始的準(zhǔn)確性，因此，該區(qū)域多態(tài)性可能影響iNOS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。從本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iNOS 基因SNP rs10459953雖與低氧訓(xùn)練前VO2max指標(biāo)存在一定關(guān)聯(lián)性，即GC基因型表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，但與低氧訓(xùn)練后VO2max、RBC、Hb等生理指標(biāo)變化并未有明顯關(guān)聯(lián)。關(guān)于此位點(diǎn)與低氧環(huán)境適應(yīng)的關(guān)聯(lián)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，僅有臨床研究認(rèn)為[10]，iNOS 基因SNP rs10459953與良性前列腺增生有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SNP rs1060822位點(diǎn)與低氧訓(xùn)練后RBC和Hb指標(biāo)有明顯關(guān)聯(lián)，CT基因型受試者在低氧訓(xùn)練Hb和RBC變化量明顯好于其它基因型，CT基因型受試者低氧訓(xùn)練后Hb、RBC分別提高1.16%、5.35%，而CC、TT基因型分別降低8.39%、5.93%和1.23%、2.66%，且CT基因型受試者在低氧定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SpO2變化也具有一定優(yōu)勢(shì)。本研究選取的SNP rs1060822位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂，iNOS基因第20外顯子2622bp處，屬于同義突變。同義突變是指DNA一維序列發(fā)生單個(gè)堿基的置換，但由于遺傳密碼子的兼并性，并不引起翻譯時(shí)氨基酸的改變。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，由于同義突變未導(dǎo)致氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，就不影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，因而不引起蛋白質(zhì)功能變化。近年來(lái)隨著對(duì)基因調(diào)控區(qū)、翻譯起始密碼子附近區(qū)域及內(nèi)含子等翻譯區(qū)突變的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)同義突變雖不引起氨基酸序列的改變，但基因編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的SNP或同義突變可由于同一氨基酸對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的翻譯效率不同，或轉(zhuǎn)錄水平的差異而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量上的改變，因此，SNP rs1060822同義突變也可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯及翻譯后加工等多環(huán)節(jié)中的某些步驟而引起iNOS蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。Yoneda M等[11]對(duì)于SNP rs1060822研究發(fā)現(xiàn)，攜帶T等位基因非酒精性脂肪肝受試者的肝活檢標(biāo)本中iNOS mRNA的表達(dá)增加，iNOS表達(dá)增加可能與機(jī)體細(xì)胞感受低氧有關(guān)，有研究報(bào)道，iNOS基因的啟動(dòng)子上有一段與低氧反應(yīng)增強(qiáng)子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，稱iNOS-HRE，可以誘導(dǎo)iNOS-HRE 的活性[6]。同時(shí)，HIF-1識(shí)別iNOS-HRE并與之結(jié)合，介導(dǎo)低氧反應(yīng)，使腎臟產(chǎn)生EPO增多，致使血漿、血清EPO濃度升高，并與紅系祖細(xì)胞膜上EPOR結(jié)合，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞由早期紅系祖細(xì)胞（BFU-E）到晚期紅系祖細(xì)胞（CFU-E）的增殖分化，最終形成成熟的紅細(xì)胞釋放入血，加強(qiáng)體內(nèi)氧氣運(yùn)送，改善組織、器官氧水平。這可能是iNOS基因SNP rs1060822位點(diǎn)與低氧訓(xùn)練血象指標(biāo)關(guān)聯(lián)的機(jī)制。此外，SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓(xùn)練前后期定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SpO2動(dòng)態(tài)曲線顯著高于初期，也表明CT基因型受試者具有良好的低氧訓(xùn)練生理效果，這與血象指標(biāo)變化相一致。有研究報(bào)道，低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)時(shí)，具有較高SpO2水平的個(gè)體，其表現(xiàn)出較好的低氧適應(yīng)及低氧運(yùn)動(dòng)能力[12]。但本研究并未觀察到SNP rs1060822與VO2max指標(biāo)關(guān)聯(lián)，其原因有待于進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

低氧訓(xùn)練后，SNP rs1060822攜帶CT 基因型受試者ΔHb、ΔRBC顯著增加；且在低氧訓(xùn)練后定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SpO2變化也表現(xiàn)一定優(yōu)勢(shì)；SNP rs10459953與個(gè)體低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)無(wú)關(guān)聯(lián)。

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[12]Luo EP， Shen GH， Wu XM，et al.Effect of oxygen-increased respirator on SaO2 and heart rate under plateau environment[J]. Space Med Med Eng （Beijing） JT - Hang tian yi xue yu yi xue gong cheng = Space medicine & medical engineering， 2005，18（4）：297-299.第30卷第1期12014年2月山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)1Journal of Shandong Institute of Physical Education and SportsVol.30 No.11February 2014

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