(南華大學(xué)第一臨床學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖南衡陽421001)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與許多細胞通路,如轉(zhuǎn)錄、細胞骨架形成、細胞成熟、細胞增殖及細胞存活。當營養(yǎng)狀況、生長條件、有絲分裂原、激素等條件發(fā)生改變時,mTOR的特殊殘基發(fā)生磷酸化,使其活性發(fā)生改變,調(diào)節(jié)自噬水平,這在許多疾病的發(fā)展過程中起重要作用,如阿爾茨海默病、帕金森氏病及亨廷頓病。本文綜述mTOR依賴的自噬相關(guān)信號途徑及其在神經(jīng)變性疾病中的意義。

1 mTOR的分子結(jié)構(gòu)特征

mTOR分子量為289kDa,C末端由保守序列組成,與磷脂酰肌醇三激酶(the phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的催化結(jié)構(gòu)域具有同源性,C末端還包括他克莫司結(jié)合蛋白(FK506-binding protein,FKBP)12-雷帕霉素結(jié)合域(FKBP12-rapamycin-binding domain,FRB),FAT[FKBP相關(guān)蛋白(FKBP-associated protein,FRAP),共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因(ataxia telengiectasia,ATM),激活/變換域相關(guān)蛋白(transactivation/transformation domain-associated protein,TRRAP)]域和 FATC(FRAP、ATM、TRRAP、C末端)域[1]。其中,FRB是FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物的結(jié)合位點:與FKBP12-FRB相鄰的 FAT域是mTOR與FKBP12蛋白相互作用的區(qū)域。mTOR的N末端至少有20個HEAT[亨廷頓蛋白(Huntingtin),延長因子3(elongation factor 3),蛋白磷酸酶-2A(a subunit of protein phosphatase-2A),TOR 1)]重復(fù)序列,這部分區(qū)域由mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,Raptor)和雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶(rapamycin-insensitive companion of mTOR,Rictor)組成[2]。在細胞內(nèi)mTOR存在mTOR復(fù)合物1(mTOR Complex 1,mTORC1)與mTOR復(fù)合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)兩種功能不同的復(fù)合體,由Raptor還是Rictor組成,決定了mTOR是形成mTORC1還是mTORC2;mTORC1和mTORC2對雷帕霉素的敏感性不同。雷帕霉素(西羅莫司)是從吸水鏈霉素的菌株中分離出來一種代謝產(chǎn)物,是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,能特異性地抑制mTOR活性。mTORC1對其敏感性高,雷帕霉素對mTORC1具有強烈的抑制作用。雷帕霉素通過與免疫親和蛋白FKBP12相結(jié)合,依附于mTOR的C末端,阻止 mTOR激活,從而抑制 mTORC1。而mTORC2對雷帕霉素不敏感,主要參與細胞極性和生長空間的調(diào)節(jié)[3]。

2 mTOR參與自噬調(diào)節(jié)的相關(guān)信號途徑

在真核生物中,自噬是高度保守的過程,它發(fā)生在細胞質(zhì)中,細胞內(nèi)過多或異常的細胞器或蛋白質(zhì)被運輸?shù)饺苊阁w中被降解。在細胞內(nèi)主要有三種類型的自噬:巨自噬(macroautophagy),微自噬(microautophary)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperonemediatedautophagy,CMA)。這些自噬過程都有一個共同點,即都是在溶酶體中實現(xiàn)蛋白質(zhì)的降解。目前,巨自噬在神經(jīng)退行性病變中的作用尤為受到關(guān)注。在自噬的活性調(diào)節(jié)中,mTOR是調(diào)節(jié)自噬信號途徑的關(guān)鍵信號分子。該自噬途徑啟動受觸發(fā)因素影響,如營養(yǎng)剝奪、胰島素和其他生長因子,這些因素可以與酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase,RTK)結(jié)合而導(dǎo)致該受體激活,而其下游信號級聯(lián)啟動涉及磷酸化胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1),IRS1的激活則直接導(dǎo)致Ⅰ類PI3K的激活,繼而激活蛋白激酶B(protein kinase B,Akt),最終激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的啟動,通過調(diào)控自噬相關(guān)基因(autophagic related genes,Atgs),磷酸化Atg13,導(dǎo)致其不能與Atg 1結(jié)合,從而阻斷自噬。雷帕霉素則通過抑制mTOR而激活自噬[4]。

2.1 PI3K/Akt信號途徑

Ⅰ類PI3K/Akt信號通路是mTOR參與自噬的一條經(jīng)典的信號途徑。當位于細胞表面的RTK和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)與相應(yīng)的細胞外配體相結(jié)合,就可以隔離PI3K的調(diào)節(jié)亞基并釋放催化亞基,使磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)磷酸化,轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峒〈既姿?phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PI3P)。PI3P是一個重要的細胞內(nèi)信號,可以與許多具有同源性底物的蛋白質(zhì)相結(jié)合,如磷脂酰肌醇依賴性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)和Akt,PDK1與PI3P在細胞膜上結(jié)合并使Akt磷酸化,激活的Akt可以使細胞核和細胞質(zhì)中許多目標蛋白磷酸化,抑制mTORC1的激活,促進自噬發(fā)生[5]。這一過程與許多調(diào)控因素有關(guān),其中,結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex,TSC)發(fā)揮了重大作用。TSC是位于mTOR上游的重要調(diào)節(jié)分子之一,對mTOR的活性起負性調(diào)節(jié)作用。TSC2是一種GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP),可以使腦內(nèi) Ras同系物(ras homolog enriched in brain,Rheb)的活化型Rheb-GTP變成不活化的 Rheb-GDP[6]。Rheb-GTP能夠與Raptor直接作用,激活mTORC1復(fù)合物。Akt磷酸化激活后,可以使TSC2磷酸化,繼而阻止TSC1/2復(fù)合物形成,激活mTORC1,抑制自噬。而第十號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10,PTEN)則對PI3K/Akt信號通路起負性調(diào)節(jié)作用,可以促進自噬發(fā)生[7]。

2.2 非依賴PI3K/Akt途徑

當某些條件發(fā)生改變,如能量發(fā)生變化、缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,可以激活肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)通路,影響mTORC1活性。LKB1是一種抑癌基因,位于AMPK上游。AMPK對能量變化很敏感,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平下降,一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/ATP升高,AMPK得到激活,活化的AMPK可以直接磷酸化TSC2,提高GAP活性,使Rheb-GTP轉(zhuǎn)變?yōu)镽heb-GDP,從而抑制mTORC1,激活自噬[8]。此外,AMPK也能通過發(fā)育及DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1(regulated indevelopment and DNA damage response 1,REDD1)調(diào)節(jié)TSC1/2的活性。在缺氧階段,AMPK還能提高REDD1的表達,將TSC2從其抑制性結(jié)合蛋白14-3-3中釋放出來,抑制mTORC1激活[9],促進自噬發(fā)生。

自噬過程的核心分子機制是Atgs,一系列由Atg基因的產(chǎn)物組成的復(fù)合物參與調(diào)節(jié)自噬的各個過程。在酵母及高等真核生物中,已經(jīng)有30多種Atgs產(chǎn)物及其同源蛋白被證實參與調(diào)節(jié)自噬過程。自噬過程是由壓力信號觸發(fā)而激活,自噬體形成的第一步受到兩個重要激酶的調(diào)控,即mTOR和III類PI3K復(fù)合體。mTOR作為自噬啟動階段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游調(diào)控因素,調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達。mTOR能夠磷酸化Atg13的哺乳動物同系物、Atg1哺乳動物同系物UNC-51樣激酶(UNC-51 like kinase,ULK)1及ULK2,阻止自噬的發(fā)展[10]。粘著斑激酶家族相互作用蛋白(FAK-family interacting protein of 200kDa,FIP200)是一種 ULK結(jié)合蛋白,FIP200和Atg13都是維持ULK1的穩(wěn)定及活性的關(guān)鍵。哺乳動物Atg13結(jié)合于ULK1/2和FIP200,激活ULKs,通過ULKs促進FIP200磷酸化。因此,這提示了在哺乳動物細胞中,激活 mTOR,磷酸化Atg13和ULKs,繼而阻止自噬。抑制mTOR,去磷酸化ULKs、Atg13,可以導(dǎo)致自噬[11]。

3 自噬與神經(jīng)變性疾病的關(guān)系

鑒于神經(jīng)細胞屬于終末分化細胞,不能進行分裂增殖,因此,通過自噬降解細胞內(nèi)衰老的細胞器以及變性蛋白等以維持細胞的穩(wěn)態(tài)顯得尤為重要。自噬功能的紊亂(過度、降低或自噬-溶酶體融合障礙)在神經(jīng)變性疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。神經(jīng)變性疾病的一個普遍的特點是功能失調(diào)的細胞器和蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)聚集,如阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson disease,PD)、亨廷頓病(Huntington disease,HD),這些有害的細胞器及蛋白質(zhì)在特定類型的神經(jīng)元中聚集,并引起神經(jīng)元功能受損,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。神經(jīng)元內(nèi)蛋白聚集程度與神經(jīng)元的毒性存在正相關(guān)關(guān)系,雖然這些蛋白聚集體的致病作用仍然存在爭議,但清除神經(jīng)元內(nèi)聚集的蛋白質(zhì)通常可以在一定程度上改善疾病的癥狀[12]。兩項應(yīng)用Atg7或Atg5缺陷的小鼠實驗證明,神經(jīng)細胞內(nèi)有聚集傾向蛋白的清除需要依靠自噬過程。阻斷自噬也能引起神經(jīng)細胞凋亡增多,也同樣解釋了在自噬缺陷小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞出現(xiàn)高水平凋亡的現(xiàn)象。因此,在神經(jīng)元胞體及突觸中,盡管激活自噬可能帶來潛在的病理性損害,但通過精細調(diào)控,局部激活自噬,有望為神經(jīng)變性疾病治療提供新思路。

3.1 阿爾茨海默病

AD是老年癡呆最常見的類型(占50% ～60%),是一類與年齡呈正相關(guān)的,以進行性認知障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)退行性病變。在神經(jīng)纖維纏結(jié)中,以過度磷酸化tau蛋白聚集為特點,在神經(jīng)元外可以看到 β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)聚集并有神經(jīng)元丟失。自噬是一種保守的依賴溶酶體的過程,也是細胞內(nèi)自我保護機制,可以降解老化的、錯誤折疊的蛋白質(zhì)及受損的細胞器。研究結(jié)果表明,神經(jīng)細胞的自噬溶酶體系統(tǒng)逐漸退化可能是AD發(fā)病的重要病理生理學(xué)機制之一[13]。早期的研究報道了阿爾茨海默型癡呆癥病人的海馬和前額葉皮層錐體神經(jīng)元中,發(fā)現(xiàn)大量積累的自嗜體,這為人們探討自噬與AD兩者的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在AD患者的大腦中,自嗜體大量累積,尤其是在營養(yǎng)不良和神經(jīng)纖維纏結(jié)的神經(jīng)細胞中。在營養(yǎng)不良的神經(jīng)細胞中,不成熟的AVs形式的顯著積累,說明在AD患者中,自嗜體轉(zhuǎn)運至溶酶體及成熟過程可能受損。這提示了在AD病人中,不適當?shù)牡鞍踪|(zhì)清除可能是由自噬溶酶體降解通路的妥協(xié)或者這條通路的改變引起的,最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙及神經(jīng)元缺失。最近的研究表明,自噬是異常聚集的Aβ和tau蛋白的一種關(guān)鍵清除途徑[14]。誘導(dǎo)自噬,可以促進聚集的Aβ和tau蛋白清除。因此,控制自噬溶酶體蛋白的退化為AD的防治提供了一種新途徑[15]。

mTOR信號途徑在控制體內(nèi)蛋白質(zhì)平衡、維持正常神經(jīng)功能過程中發(fā)揮必不可少的作用。mTOR信號途徑可以調(diào)控許多形式的記憶和學(xué)習(xí)功能。在AD動物模型中,mTOR信號途徑抑制劑雷帕霉素通過增強自噬來改善認知功能障礙,其機制與減輕Aβ及tau蛋白的病理損傷作用相關(guān)[16]。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,長期使用雷帕霉素抑制mTOR,可以阻止AD樣認知功能障礙,降低Aβ水平[17]。上述結(jié)果表明mTOR抑制劑可以通過增強自噬,降低Aβ、改善認知功能,這為AD模型的改善認知功能障礙的治療提供了可行的治療思路。

3.2 帕金森氏病

PD是大腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元丟失,以靜止性震顫、肌強直及運動遲緩的運動障礙為特征的一種疾病。帕金森氏病有兩大病理學(xué)特點,其一是黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元選擇性喪失,其二是殘留在神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)由α-突觸核蛋白和泛素構(gòu)成的嗜酸性包涵體—路易小體(Lewy bodys,LB)。PD患者黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)檢查結(jié)果顯示在變性的含色素的神經(jīng)元中可見明顯的細胞凋亡和自噬的特點。隨后的研究表明,PD致病性標志LB的主要成分α-突觸核蛋白是由巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬所降解[18]。

自噬對于PD的形成過程中具有雙重作用,疾病發(fā)生早期,適度激活自噬具有保護作用;而隨著疾病的發(fā)展,當損傷作用超過自噬的代償范圍,自噬則扮演著促進多巴胺神經(jīng)元死亡的作用,而自噬的這一作用已在PD病人大腦尸檢以及多種模型上得以證實。氧化應(yīng)激是帕金森氏病的重要致病機制之一,Gomez-Santos團隊應(yīng)用多巴胺毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激,發(fā)現(xiàn)自噬體的數(shù)量和神經(jīng)細胞死亡數(shù)均大大增加[19]。在氧化應(yīng)激的細胞培養(yǎng)模型中,抑制mTOR活性可以通過激活自噬導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細胞死亡[20]。REDD1是mTORC1抑制劑。在PD病人的多巴胺能神經(jīng)元中,REDD1表達上調(diào),在PD的細胞模型中,REDD1高表達[21]。REDD1可以通過抑制mTOR活性導(dǎo)致細胞死亡。因此,恢復(fù)mTOR的活性可以對抗REDD1,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而,在轉(zhuǎn)基因小鼠中,抑制mTOR、促進自噬可以減少有害的α-突觸核蛋白聚集,減輕神經(jīng)退行性改變[22]。

因此,PD的治療關(guān)鍵可能是激活mTOR信號途徑和減少自噬。而在PD中,mTOR的激活可能需要一個合適的調(diào)控水平[23]。

3.3 亨廷頓病

HD是一種基底節(jié)和大腦皮質(zhì)變性疾病。其臨床特征主要表現(xiàn)為認知障礙和精神癥狀,但最主要的表現(xiàn)是運動障礙,如舞蹈病、癲癇發(fā)作、不自主運動和肌張力障礙。HD是一種常染色體顯性遺傳性運動障礙疾病,該基因造成在亨廷頓(Huntingtin,Htt)基因內(nèi),三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)異常增多(＞35拷貝),導(dǎo)致Htt蛋白的N末端,三核苷酸重復(fù)序列編碼一段長的多聚谷氨酰胺功能區(qū)。因此,神經(jīng)細胞內(nèi)N-末端殘基的聚集是造成變異Htt蛋白毒性的主要原因,也是HD疾病的重要標志。

抑制mTOR信號途徑、激活自噬可能是治療HD的新思路。研究表明,亨廷頓蛋白可以引起神經(jīng)元退化,而自噬能夠清除亨廷頓蛋白的細胞內(nèi)聚集,因此,自噬在亨廷頓病過程中至關(guān)重要。在HD模型中早期觀察到AVs和自噬的增加,是細胞利用自噬嘗試盡可能地清除突變型Htt蛋白,而隨著時間的變化,突變型Htt蛋白的積累遠遠超過了細胞自噬所能負荷的范圍,導(dǎo)致細胞自噬功能紊亂,導(dǎo)致HD的發(fā)生[24]。在HD細胞模型中,雷帕霉素抑制mTOR激活,可以通過增加細胞自噬,而達到清除多聚谷氨酰胺聚集物的作用[25],在蒼蠅和小鼠動物模型中,可以減少亨廷頓蛋白聚集及細胞死亡,避免神經(jīng)退行性病變[26]。此外,在果蠅模型中,一些小分子可以強化mTOR的抑制,有利于 Htt蛋白的清除[27]。然而,在一些實驗性的HD模型中,僅抑制mTORC1,而不是兩種復(fù)合體都抑制,不會影響自噬或Htt蛋白的聚集。相比之下,自噬和減少Htt蛋白的聚集需要抑制mTORC1和mTORC2的結(jié)合,這提示mTOR信號途徑眾多信號分子可能共同參與HD的病理生理學(xué)機制[28]。調(diào)控mTOR信號途徑的神經(jīng)保護作用還可能與DNA破壞蛋白34(DNA damage protein 34,GADD34)有關(guān)。在HD細胞模型中,GADD34可以導(dǎo)致TSC2去磷酸化,誘導(dǎo)自噬,因此,當GADD34過度表達時,細胞存活率增加[29]。

4 展 望

大量的證據(jù)表明,自噬不論在正常的大腦神經(jīng)元中還是病理條件下都有重要作用。當?shù)鞍踪|(zhì)和細胞器受到損害,導(dǎo)致有害的蛋白質(zhì)聚集,擾亂正常的神經(jīng)細胞功能,最終可以導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病,如AD、PD 及 HD。

圖1 mTOR依賴的自噬通路與神經(jīng)變性疾病

mTOR調(diào)控廣泛的細胞通路,并通過多條信號途徑來調(diào)節(jié)自噬(圖1),這提示mTOR可能對細胞保護和細胞生存有重要影響,也能防止老化所致的功能障礙并延長壽命。然而,在神經(jīng)系統(tǒng)中,mTOR在許多疾病中的作用及其機制尚不完全清楚,研究的結(jié)果也不一致。例如,在AD中,激活mTOR可能可以通過阻止Aβ暴露來防止神經(jīng)退行性變,控制認知功能下降。但是,其他一些研究表明,激活mTOR下游的信號途徑能夠?qū)е聇au蛋白過度磷酸化和神經(jīng)元纖維聚集,而抑制mTOR,激活自噬,可以減少Aβ。因此,調(diào)控mTOR的活性也可能產(chǎn)生一些不可預(yù)知的不利結(jié)果。mTOR作為自噬調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵靶點,闡明其復(fù)雜性及其信號途徑來控制潛在的危害,這對神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供有效的治療方案是至關(guān)重要的。

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