謝朝暉等

摘要 目的：觀察5烯丙基7二氟甲氧基白楊素（AFMC） ）是否協(xié)同腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡.并探討其機(jī)制是否涉及死亡受體5（DR5）的上調(diào).方法：體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞和人胚肺WI38細(xì)胞.碘化丙啶（PI）染色流式細(xì)胞術(shù)（FCM）定量分析細(xì)胞凋亡率；DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞DNA梯形條帶；Western Blotting 檢測DR5蛋白表達(dá).結(jié)果：單獨用亞毒性濃度的AFMC（1.0 μmol/L） 或TRAIL（30 μg/L）處理A549細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率不超過5%.AFMC（1.0 μmol/L）聯(lián)合TRAIL（30 μg/L）的A549細(xì)胞凋亡率增高（37.80%， P<0.01）；而WI38細(xì)胞僅有極少量的細(xì)胞凋亡（P>0.05）.DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：兩者合用A549細(xì)胞呈現(xiàn)典型的DNA梯形條帶圖譜，而WI38細(xì)胞未出現(xiàn)DNA梯形條帶；Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)：AFMC呈濃度和時間依賴性上調(diào)A549細(xì)胞DR5的表達(dá)，DR5特異性抑制劑DR5/Fc嵌合蛋白能有效降低兩者合用誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞凋亡率（P<0.05）.然而，AFMC對WI38細(xì)胞DR5表達(dá)無明顯影響.結(jié)論：亞毒性濃度的AFMC選擇性增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡.其機(jī)制可能與其上調(diào) DR5表達(dá)有關(guān).

關(guān)鍵詞 肺癌；5烯丙基7二氟甲氧基白楊素；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；死亡受體5；細(xì)胞凋亡

中圖分類號 R966 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號1000-2537（2014）01-0022-06

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNFrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL） 及其受體（“死亡”受體：DR4和DR5）屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，它具有選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性的生物學(xué)特點，成為了一種極具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的腫瘤靶向治療因子.但有研究證實，超過50%的腫瘤細(xì)胞對TRAIL不敏感[1].慶幸的是，越來越多的實驗結(jié)果表明TRAIL 與化療或放療藥物聯(lián)合治療能克服大多數(shù)腫瘤細(xì)胞對TRAIL 的耐受并獲得協(xié)同殺傷效應(yīng)[2].

白楊素（5，7二羥基黃酮，ChR）是從多種植物、蜂膠和蜂蜜中提取的一種具有廣泛生物活性的天然食源性黃酮.有研究報道指出：白楊素對非小細(xì)胞肺癌、惡性膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、白血病、食道鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抗增殖活性和凋亡誘導(dǎo)作用，而對正常細(xì)胞未見明顯毒性[3].但由于其腸道吸收甚少且5，7位羥基易被迅速糖基化代謝，導(dǎo)致該化合物的生物利用度降低，體內(nèi)活性較低，因此，其應(yīng)用受到限制[4].為此，作者以ChR為先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)修飾得到ChR類似物5烯丙基7二氟甲氧基白楊素（5allyl7gendifluoromethoxy chrysin，AFMC）.在前期研究中，作者證明AFMC具有較ChR更強(qiáng)的誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞[5]、人卵巢癌CoC1細(xì)胞 [6]、人肺癌A549細(xì)胞[7]凋亡作用.

Ding等[8]證實白楊素能通過下調(diào)cFLIP，上調(diào)TRAILR2（DR5）增強(qiáng)TRAIL介導(dǎo)的白血病ATL、乳腺癌MDAMB231、結(jié)腸癌HT29、肝細(xì)胞癌HepG2、黑色素瘤細(xì)胞SKMEL37、胰腺癌Capan1等多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡.Jin等[9]報道白楊素類似物柚皮素通過上調(diào)DR5增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞TRAIL耐藥株對TRAIL的敏感性.本文研究亞細(xì)胞毒濃度的AFMC是否通過上調(diào)DR5表達(dá)，增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡.

1材料和方法

1.1試劑

5烯丙基7二氟甲氧基白楊素（AFMC）按照文獻(xiàn)[10]方法合成，分子式：C19O4H14F2；相對分子質(zhì)量：344，性狀：淡黃色晶體；純度：99.0%.白楊素（ChR）和碘化丙啶（PI）為Sigma公司產(chǎn)品；重組人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）由PeproTech公司生產(chǎn)；DNA Ladder檢測試劑盒購于北京博大泰克公司；重組人DR5/Fc嵌合蛋白購自R&D Systems （Minneapolis，MN）.

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國武漢）；人胚肺WI38細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）.在37 ℃、5% CO2（體積分?jǐn)?shù)，下同）及飽合濕度條件下，用含10%小牛血清，1667 mkat/L（即105 U/L）青霉素及1667 mkat/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞用于各項實驗.

1.3流式細(xì)胞術(shù)分析

取對數(shù)生長期細(xì)胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基處理24 h進(jìn)行細(xì)胞周期同步化后，分別加入含AFMC （1.0 μmol/L）、TRAIL（30 μg/L）以及兩者合用的完全培養(yǎng)基孵育24 h；0.2% DMSO作為溶媒對照.收集細(xì)胞，加入PBS制備單細(xì)胞懸浮液， 再用冷卻的PBS沖洗2次， 用70%酒精4 ℃ 固定24 h， PI染色后用流式細(xì)胞儀（American BD Company， FACS420）檢測細(xì)胞凋亡.

1.4DNA瓊脂糖凝膠電泳

收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，按照DNA Ladder Detection Kit說明書操作，提取細(xì)胞DNA， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段.

1.5Western Blotting分析

收集不同處理組細(xì)胞，PBS洗滌3次，用細(xì)胞裂解液（0.1 mol/L NaCl， 0.01 mol/L Triscl（pH 7.6）， 0001 mol/L EDTA（pH 8.0）， 1 mg/L Aprotinin， 100 mg/L PMSF）裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白.每組取25 μg蛋白樣品進(jìn)行10% SDSPAGE電泳（100 mA， 3 h），轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，然后分別加入1∶〖KG-2mm〗1 000稀釋的DR5（p48）和βactin一抗，37 ℃孵育2 h；TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次15 min.ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影.實驗中以βactin作為內(nèi)參照蛋白.

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 15.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫（SPSS Inc， Chicago， IL），并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.數(shù)據(jù)表示為±s，經(jīng)方差齊性檢驗后，用單向方差分析（One Way ANOVA）對多組均值進(jìn)行比較，用LSD法對均值進(jìn)行兩兩比較.P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn).

2結(jié)果

21亞毒性濃度的AFMC、TRAIL及兩者合用對人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

PI染色FCM分析顯示：1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL單用以及兩者合用的A549細(xì)胞凋亡率（SubG1細(xì)胞百分率）分別為2.53%±0.35%，269%±0.52%，37.80%±1.78%.兩者合用的細(xì)胞凋亡率是各自單用時細(xì)胞凋亡率之和的7.2倍（P<0.05，圖1）.A549細(xì)胞凋亡率在兩者合用12 h后開始增加，24 h達(dá)高峰（圖2）.提示亞毒性濃度的AFMC能增敏TRAIL誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡.

22 亞毒性濃度的AFMC、TRAIL及兩者合用對人肺癌A549細(xì)胞DNA斷裂的影響

DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示： 1.0 μmol/L AFMC或30 μg/L TRAIL分別作用于人肺癌A549細(xì)胞24 h，未見凋亡特異性的DNA梯形條帶，而1.0 μmol/L AFMC預(yù)孵育30 min后，再加入30 μg/L TRAIL處理24 h，展現(xiàn)典型DNA梯形條帶圖譜（圖3A）.進(jìn)一步證實：亞毒性濃度的AFMC具有增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡作用.

23AFMC對人肺癌A549細(xì)胞DR5蛋白表達(dá)的影響

Western Blotting分析表明：AFMC以濃度和時間依賴方式上調(diào)A549細(xì)胞DR5蛋白表達(dá)，DR5表達(dá)在AFMC作用6 h后開始增加，先于AFMC和TRAIL兩者合用12 h后引起的細(xì)胞凋亡率增加（圖4A，圖5）.

24DR5拮抗性抗體對AFMC增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡作用影響

DR5拮抗性抗體DR5/Fc嵌合蛋白能使亞毒性濃度AFMC和TRAIL合用的A549細(xì)胞凋亡率從37.80%±1.78%下降至7.61%± 0.32%（ P<0.05，圖6），表明AFMC上調(diào)DR5表達(dá)是其增敏作用的機(jī)制之一.

25AFMC、TRAIL及兩者合用對人胚肺WI38細(xì)胞的影響

1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL分別單用或兩者聯(lián)合處理人胚肺WI38細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率與溶媒組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖1）.AFMC、TRAIL無論單用或合用于WI38細(xì)胞24 h，均未呈現(xiàn)凋亡特異性的DNA梯形條帶（圖3B）.AFMC對WI38細(xì)胞DR5表達(dá)無明顯影響（圖4B）.說明：亞毒性濃度的AFMC 對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的增敏作用具有肺癌細(xì)胞選擇性，與其選擇性上調(diào)肺癌細(xì)胞DR5 表達(dá)有關(guān).

3討論

肺癌系全世界最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有100～130萬患者死于肺癌.我國衛(wèi)生部2008年4月29日公布的第三次全國居民死亡原因調(diào)查顯示，過去30年間我國肺癌死亡率上升了465%，肺癌已位居我國惡性腫瘤死亡率之首.其中約80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），NSCLC發(fā)病隱匿，早期不易診斷，確診時多為中、晚期，已喪失手術(shù)良機(jī).目前治療NSCLC的藥物因其非選擇性殺傷作用和較強(qiáng)的毒副反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限.臨床仍采取以化療為主的綜合治療，但5年生存率仍低于15%，并且極易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[11].尋求高效、低毒的新型抗肺癌藥物是當(dāng)前腫瘤防治研究的熱點.

TRAIL是1995年發(fā)現(xiàn)的與FasL和TNFα有較高同源性的TNF超家族成員.它們都能與靶細(xì)胞膜上特異性DR4和DR5受體結(jié)合，通過多種死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡.與TNF、FASL不同，TRAIL能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞凋亡，而對肝細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等正常細(xì)胞幾乎無毒性.大量臨床前實驗證實TRAIL能有效地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系凋亡 [12].然而隨著研究的深入，越來越多的腫瘤細(xì)胞尤其是一些惡性腫瘤對TRAIL存在先天性或獲得性耐受[2].如何有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的凋亡抵抗是當(dāng)前亟待解決的問題.研究表明，細(xì)胞表面DR4和DR5的表達(dá)水平是決定腫瘤細(xì)胞對TRAIL敏感性的關(guān)鍵，而且在正常37 ℃的生理條件下， TRAIL與其受體結(jié)合，DR5的親和力最強(qiáng)，從而在TRAIL誘導(dǎo)的凋亡通路中發(fā)揮最大作用[13].如何上調(diào)DR尤其是DR5的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的TRAIL敏感性，充分發(fā)揮TRAIL的選擇性殺傷效應(yīng)成為近年研究的熱點.

作者前期研究通過細(xì)胞毒實驗確定了AFMC和TRAIL的亞毒性（細(xì)胞毒性<15%）濃度，證實人肺癌A549細(xì)胞對TRAIL耐藥且AFMC能選擇性增強(qiáng)TRAIL對A549細(xì)胞毒作用[14].那么，這種細(xì)胞毒增敏效應(yīng)是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)？本文通過FCM分析和瓊脂糖凝膠電泳證明，亞毒性濃度的AFMC與TRAIL聯(lián)用能協(xié)同誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡.文獻(xiàn)報道[8]，白楊素能通過上調(diào)DR5表達(dá)增強(qiáng)TRAIL對多種惡性腫瘤的凋亡誘導(dǎo)作用.前期研究中，作者發(fā)現(xiàn)不同濃度AFMC對A549細(xì)胞DR4的表達(dá)未見明顯影響.Western Blotting檢測AFMC呈濃度和時間依賴方式上調(diào)DR5表達(dá).DR5拮抗性抗體DR5/Fc嵌合蛋白能使AFMC和TRAIL合用的A549細(xì)胞凋亡率顯著下降.提示DR5的表達(dá)上調(diào)是AFMC增敏TRAIL誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一.前期研究表明AFMC和TRAIL合用對永生化二倍體人胚肺WI38細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，本文同樣證實了兩者合用對WI38細(xì)胞無明顯凋亡誘導(dǎo)作用，且AFMC對WI38細(xì)胞DR5表達(dá)無影響.綜合以上結(jié)果作者推測：AFMC選擇性增敏TRAIL 誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡，與其上調(diào)DR5 表達(dá)有關(guān).關(guān)于AFMC如何上調(diào)DR5的具體機(jī)制仍有待深入研究和探討.本文結(jié)果可為將天然食源性黃酮化學(xué)改造，開發(fā)基于TRAIL抗腫瘤治療提供新途徑.

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（編輯王?。?

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（編輯王?。?

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（編輯王健）