黃燕婷勞均平

沉默VEGF基因?qū)ο贅幽倚园┘?xì)胞侵襲的影響*

黃燕婷①勞均平①

目的：利用RNAi技術(shù)沉默腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2中VEGF的表達(dá)，探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。方法：利用RNAi技術(shù)沉默VEGF表達(dá)，用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力的變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，VEGF的siRNA能有效地抑制實(shí)驗(yàn)組ACC-2細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)論：沉默VEGF減弱腺樣囊性癌的侵襲能力。

涎腺腺樣囊性癌； 血管內(nèi)皮生長因子； RNA干擾； 侵襲

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的六分之一。腺樣囊性癌具有嗜神經(jīng)侵襲以及跳躍性轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。手術(shù)預(yù)后差，侵襲以及轉(zhuǎn)移是患者的主要病因之一[1-2]。

血管內(nèi)皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強(qiáng)烈誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子，在腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌以及胚胎組織性腫瘤中多有報(bào)道。腫瘤組織中VEGF表達(dá)水平與惡性程度成正相關(guān)，并明顯高于非腫瘤組織[3-4]。這表明VEGF可能通過促進(jìn)血管形成等方式促進(jìn)腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腺樣囊性癌細(xì)胞系低轉(zhuǎn)移株（ACC-2）由中山大學(xué)附屬孫逸仙醫(yī)院李勁松教授饋贈(zèng)。兩株細(xì)胞培養(yǎng)于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染 VEGF特異性干擾片段參照之前文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。片段序列為：GGCGTCGCACTGAAACTTT，由吉瑪生物合成。

1.3 mRNA的提取和檢測(cè) 細(xì)胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取細(xì)胞株中總的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）。VEGF引物的設(shè)計(jì)如下：VEGF基因：上游引物：5’-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3’；下游引物：5’-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3’。內(nèi)參GAPDH基因：上游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3’；下游引物：5’-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3’。

1.4 Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后的ACC-2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。分別取50 μg蛋白，97 ℃變性后，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，將凝膠置于轉(zhuǎn)移平衡緩沖液中，再以200 V行電泳跑膠，時(shí)間1 h。再以25 V電壓1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶（TBST溶解）封閉1 h；10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育過夜；漂洗TBST 3次，10 min/次；10%FBS/TBST加二抗室溫下孵育1 h，漂洗TBST 3次，10 min/次。取等量的ECL發(fā)光試劑A、B液，混勻后，孵育硝酸纖維素膜，曝光，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，“饑餓”12 h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24孔板下室加入450 μL含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。采用0.1%結(jié)晶紫染色。選擇相同位置的3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 VEGF的表達(dá)變化

2.2 VEGF表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制腺樣囊性癌細(xì)胞的侵襲能力 利用VEGF的siRNA對(duì)ACC-2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)進(jìn)行抑制，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACC-2細(xì)胞的侵襲能力的變化。結(jié)果顯示：在ACC-2細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 細(xì)胞侵襲能力的變化

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強(qiáng)烈誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子，VEGF的表達(dá)廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中，它的表達(dá)與轉(zhuǎn)化生長因子B（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、NO以及一些重金屬離子有關(guān)，還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤組織中VEGF表達(dá)水平與惡性程度成正相關(guān)，并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進(jìn)血管形成等方式促進(jìn)腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)能從多方面影響腫瘤的脈管生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移，與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對(duì)ACC-2侵襲的調(diào)控能力，但針對(duì)ACC-2侵襲的調(diào)控的具體信號(hào)通路還需要做進(jìn)一步的研究。并且需要做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，希望以后可以為以VEGF為靶點(diǎn)的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據(jù)。

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The Study of the Influence on Invasiveness Activity of ACC-2 Cells Via RNAi VEGF

HUANG Yan-ting，LAO Jun-ping.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：037-038

Objective：To investigate the inhibitory effects of VEGF targeted small interference RNA（siRNA） on invasiveness of salivary adenoid cystic carcinoma（SACC） cell line ACC-2.Method：VEGFsiRNA was transfect into SACC cell line ACC-2 and then examine the changes of invasive ability of ACC-M.Result：The invasive and proliferative abilities of ACC-2 decreased， and the difference between the two groups were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Si-VEGF can effectively decrease invasiveness of SACC cells.

Salivary adenoid cystic carcinoma； Vasculare endothelial growth factor； RNA interference；Invasiveness

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.013

2014-02-17） （本文編輯：黃新珍）

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（B2011302）

①廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 廣東 佛山 528000

勞均平

First-author’s address：The First People’s Hospital of Foshan City，F(xiàn)oshan 528000，China