耿梅英，苑方重，楊 倩，鐘秀會(huì)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定071000）

金黃色葡萄球菌(SA)是一種廣泛存在于自然界的病原菌，人及多種動(dòng)物均能感染發(fā)病，其中對(duì)肉雞危害較為嚴(yán)重[1-2]。肉雞發(fā)病后，臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、壞死性皮炎、關(guān)節(jié)炎、雛雞臍炎、全眼球炎和骨膜炎，其中30～40日齡肉雞發(fā)病最多，每年給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。SA還可以產(chǎn)生多種引起急性胃腸炎的腸毒素（Staphylococcal en?terotoxins，SEs），包括A-E，F(xiàn)，G-I，R-T等20多種類型，可以引起機(jī)體中毒[3-6]；其中，SEA、SEB型可以結(jié)合MHCⅡ型抗原遞呈細(xì)胞，并激活T細(xì)胞，是最典型的腸毒素，被稱為超級(jí)抗原[6]。

相對(duì)于抗生素，中藥方劑具有低藥殘留、無公害、不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)，可作為肉雞葡萄球菌病治療的首要選擇。很多研究表明，黃連、金銀花、連翹等中藥有良好的抗菌作用。本試驗(yàn)選用清瘟敗毒散作為基本方劑進(jìn)行加減，以黃連、金銀花、連翹等抗菌中藥為主藥，配伍丹皮、黃芩、甘草等中藥，辨證組方，用于治療肉雞葡萄球菌病的研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923（中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心）；臨床分離株S.aureus，分離自河北某地幾家肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)卻甫曼培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，及生化試驗(yàn)鑒定后保存應(yīng)用（圖1純化培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌）。Bradford蛋白定量試劑盒，購(gòu)自北京研和翔試劑公司；SEA,SEB抗體，購(gòu)自Sigma公司。0.22μm濾膜由北京卓信偉業(yè)科技有限公司供應(yīng)。中藥黃連、金銀花、連翹等，購(gòu)自保定萬寶堂藥房，組成試驗(yàn)方劑，合并后采用水煎濃縮方法，藥物最終濃度為1 g/mL生藥，試驗(yàn)用單味中藥采用同樣方法制備。

1.2 常用抗菌藥物耐藥性試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株與分離株分別接種于普通平板培養(yǎng)基，選擇鏈霉素、青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、林可霉素、卡那霉素、恩諾沙星、四環(huán)素等8種常用抗菌藥物的藥敏紙片，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，參考美國(guó)抗微生物藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)CLSI[7-8]，判斷藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的抑菌效果。

1.3 中藥敏感性試驗(yàn)及MIC 試驗(yàn)中使用清瘟敗毒散提取液，及組成該方的主要藥物黃連、金銀花、連翹、甘草、丹皮分別制成單藥提取液。將細(xì)菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采用挖洞注藥法做藥物平板抑菌試驗(yàn)。在已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基上均勻打孔，將藥注滿孔，在4℃條件下放置2 h，然后于37℃培養(yǎng)24 h，使用卡尺測(cè)藥物對(duì)該細(xì)菌抑菌環(huán)直徑的大小，以確定藥物對(duì)細(xì)菌的作用效果。

利用普通試管，做營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將清瘟敗毒散提取液及單味中藥提取液，均采用等比稀釋的方法，做成濃度系列。濃度范圍是1 g/mL～2-10g/mL生藥，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯中，同時(shí)接種細(xì)菌，以不加藥物的作空白對(duì)比，在37℃下培養(yǎng)24 h，觀察含有藥物的肉湯中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，確定藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC），判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)M27-A3[8]。

1.4 清瘟敗毒散對(duì)S.aureus腸毒素生成的影響

根據(jù)MIC試驗(yàn)結(jié)果，在接種試驗(yàn)菌株的LB培養(yǎng)基中MIC濃度的清瘟敗毒散方劑提取液，并進(jìn)行倍比稀釋，以不添加藥液的培養(yǎng)基做對(duì)照，37℃下培養(yǎng)24 h，收集各培養(yǎng)基菌液上清，取20μL，采用Western blot方法測(cè)定菌液中S.aureus腸毒素SEA、SEB。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌耐藥試驗(yàn) 參照標(biāo)準(zhǔn)，抑菌環(huán)直徑大于20mm為超敏；抑菌圈直徑在15mm～20mm，表現(xiàn)為高敏；抑菌圈直徑在10mm～14mm，表現(xiàn)為中敏；抑菌圈直徑小于10mm，表現(xiàn)為低敏；無明顯的抑菌圈，表現(xiàn)為耐藥。各分離株SA及標(biāo)準(zhǔn)株耐藥狀況如表1所示。臨床分離的菌株林可霉素敏感性較高，對(duì)鏈霉素與四環(huán)素的耐受性普遍較強(qiáng)，其中大部分菌株出現(xiàn)耐藥，藥敏試驗(yàn)沒有出現(xiàn)抑菌環(huán)；同時(shí)，各分離菌株對(duì)卡那霉素與氨芐青霉素敏感性較低，并且有菌株表現(xiàn)耐藥；其他藥物反應(yīng)多表現(xiàn)中等程度的敏感。試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，臨床分離的SA對(duì)常用抗菌藥物敏感性差異較大。其中，編號(hào)SA9-7菌株對(duì)多種藥物明顯耐藥。試驗(yàn)中，我們選擇SA9-7做中藥抑菌試驗(yàn)。

表1 金黃色葡萄球菌耐藥性分析（抑菌環(huán)直徑=mm）

2.2 中藥敏感性試驗(yàn)及MIC 中藥方劑清瘟敗毒散及組成方劑的部分單味中藥對(duì)臨床分離菌株SA9-7及標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923的抑菌效果見表2。

表2 中藥對(duì)SA9-7及ATCC25923抑菌（抑菌環(huán)直徑=mm）

試驗(yàn)結(jié)果顯示，清瘟敗毒散提取液對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌SA9-7株具有良好的抑制作用。盡管該菌對(duì)常用抗菌藥物有較強(qiáng)的耐藥性，但對(duì)純中藥方劑清瘟敗毒散的敏感性較高。同時(shí)，在組成中藥方劑的單味中藥中，黃連、金銀花、連翹對(duì)SA9-7的抑制作用也比較明顯；而丹皮、甘草在單獨(dú)使用時(shí)對(duì)該菌沒有明顯效果。同時(shí)，試驗(yàn)方劑的抑菌作用顯著好于單味中藥。方劑及單味中藥對(duì)SA9-7的抑制效果見圖1。

對(duì)于藥物最小抑菌濃度（MIC）的判斷，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)M27-A3。結(jié)果顯示，試驗(yàn)方劑清瘟敗毒散提取液對(duì)SA9-7的MIC為0.016 g/mL，黃連單味藥物對(duì)該菌的MIC為0.063 g/mL，其他金銀花、連翹、丹皮和甘草依次為：0.063 g/mL、0.250 g/mL和0.125 g/mL。此外，試驗(yàn)中藥方劑對(duì)ATCC25923的MIC為0.008 g/mL。

圖1 方劑及單味中藥對(duì)SA9-7的抑制效果

2.3 清瘟敗毒散對(duì)S.aureus腸毒素生成的影響

從臨床分離的金黃色葡萄球菌，約1/3可以產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是一種可溶性蛋白質(zhì)，耐熱，經(jīng)100℃煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響[9]，是造成畜產(chǎn)品包括雞肉等污染的主要因素，也是金黃色葡萄球菌的主要毒力評(píng)價(jià)因子之一[3]，其中SEA、SEB型通常被認(rèn)為是S.aureus腸毒素的標(biāo)志性類型。試驗(yàn)中，應(yīng)用特異性抗體檢測(cè)不同中藥濃度下，臨床分離株SA9-7腸毒素SEA、SEB的生成。結(jié)果如圖2顯示，在有S.aureus生長(zhǎng)的情況下，中藥清瘟敗毒散提取液可以顯著抑制SEA與SEB的生成，并且其作用強(qiáng)度與藥物的濃度密切相關(guān)。

圖2清瘟敗毒散對(duì)S.aureus腸毒素的抑制作用

3 討論

本試驗(yàn)表明，自肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)臨床分離的S.au?reus菌株，對(duì)多種常用抗菌藥物的敏感性不高，有不少的菌株對(duì)四環(huán)素、青霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等藥物表現(xiàn)出明顯的耐藥性。在當(dāng)前情況下，很多養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞感染S.aureus后，普遍存在治療困難，大劑量合并使用抗菌藥物，是通常采用的主要方法之一，同時(shí)又是造成S.aureus耐藥的原因之一。試驗(yàn)中，臨床分離的菌株SA9-7，對(duì)本試驗(yàn)選擇的8種藥物均不敏感，并對(duì)其中4種藥物表現(xiàn)為耐藥，而這種廣譜耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)該病的治療構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

相對(duì)于抗生素，中藥方劑具有低藥殘留、無公害、不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)，可作為肉雞葡萄球菌病治療的首要選擇。很多研究表明，黃連、金銀花、連翹等中藥有良好的抗菌作用。本試驗(yàn)選用的中藥方劑清瘟敗毒散，根據(jù)中獸醫(yī)理論，以黃連、金銀花、連翹等抗菌中藥為主藥，配伍丹皮、黃芩、甘草等中藥組成，并通過水浸水煎，制成中藥提取液。試驗(yàn)結(jié)果顯示，清瘟敗毒散提取液對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌SA9-7株具有良好的抑制作用，對(duì)SA9-7的MIC為0.016 g/mL；同時(shí)，藥物可以顯著抑制S.aureus腸毒素SEA、SEB的生成。本試驗(yàn)探討了中藥治療肉雞葡萄球菌病的可能性，為防治禽葡萄球菌病提供了技術(shù)支持。

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