王計(jì)平，鄔繼文，呂龍寶

（中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明650223）

非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物在世界各國(guó)生物醫(yī)學(xué)研究中的作用日趨重要。猴皰疹病毒1型（B病毒）可以使人產(chǎn)生致死性感染[1]。B病毒感染獼猴、食蟹猴非常普遍，而且常常不伴有臨床癥狀或者潛伏感染。感染動(dòng)物黏液、皮膚、口腔、生殖道分泌物均可傳染給其他動(dòng)物。目前用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用猴群中B病毒感染主要是用人單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）作為抗原片、玻片免疫酶（IEA）檢測(cè)抗體的方法。曾有報(bào)道[2]，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)方法用于猴B病毒抗體檢測(cè)。

隨著生物醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，無(wú)B病毒感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物需求量越來(lái)越大，本文采用HSV-1為抗原，IEA檢測(cè)抗體方法對(duì)我中心飼養(yǎng)768只，2～4歲齡獼猴B病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。檢出482只每隔2周連續(xù)檢測(cè)4次及每年檢測(cè)1次，連續(xù)檢測(cè)3年B病毒感染1.05%，說(shuō)明B病毒抗體陰性猴再次感染率不高。用人單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1），猴皰疹病毒為抗原，采用IEA和ELISA檢測(cè)方法抽檢，72只B病毒抗體陽(yáng)性母猴所生仔猴，5～6個(gè)月齡斷奶單籠關(guān)養(yǎng)后，檢測(cè)B病毒抗體，有3只仔猴B病毒抗體陽(yáng)性，69只仔猴B病毒抗體陰性，陰性率為98.6%，說(shuō)明母猴抗體陽(yáng)性垂直傳染給仔猴幾率極低[3-5]。

1 材料與方法

1.1 大籠飼養(yǎng)健康實(shí)驗(yàn)獼猴768只，雌雄各半。129只生育母猴，其中72只B病毒抗體陽(yáng)性母猴生仔猴，單籠關(guān)養(yǎng)5～6月齡。

1.2 靜脈采血，3 000 r／min離心8min，分離血清。56℃、滅活30min，用樣品稀釋液1∶10稀釋，待查。

1.3 HSV-1抗原片，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.4 B病毒ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自珠海海泰生物制藥有限公司。

1.5 其余試劑均采用國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。

1.6 B病毒ELISA檢測(cè)試劑盒。結(jié)果判定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)A450＜0.15為陰性，A450=0.1-0.2為可疑，A450＞0.21為陽(yáng)性。

1.7 猴B病毒抗體檢測(cè)，以HSV-1為抗原，用IEA檢測(cè)法，檢查猴B病毒抗體，結(jié)果判定按說(shuō)明書的指導(dǎo)進(jìn)行。

表1 自繁殖仔猴B病毒抗體檢測(cè)

2檢測(cè)結(jié)果

2.1 獼猴B病毒檢查結(jié)果。用IEA方法檢查768只，B病毒抗體陰性482只，陽(yáng)性286只。

2.2 將482只B病毒抗體陰性獼猴分群?jiǎn)为?dú)飼養(yǎng)，1個(gè)月后每隔兩周用IEA法進(jìn)行B病毒抗體檢測(cè)。于2005年3月1日、3月15日、3月30日和4月15日分4次檢測(cè)結(jié)果表明，第1次檢出B病毒抗體陽(yáng)性猴3只，第2、第3次各檢出4只，第4次檢出6只。檢出率分別0.62%；0.83%；1.26%

2.3 將476只B病毒抗體陰性獼猴大籠群養(yǎng)，每籠8～10只。2006年3月至2008年3月每隔1年用IEA法進(jìn)行B病毒抗體檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)3年。3次檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1年檢出B病毒抗體陽(yáng)性猴3只，檢出率0.6%；第2、第3次各檢出5只，檢出率1.05%。每次檢出B病毒抗體陽(yáng)性動(dòng)物隔離關(guān)養(yǎng)，次年再檢為陽(yáng)性。3年的連續(xù)檢測(cè)，陽(yáng)性感染率1.05%。為日后群養(yǎng)動(dòng)物提供可行依據(jù)。

2.4 用HSV-1抗原片IEA方法和ELISA，抽檢129只母猴所生仔猴，其中72只B病毒抗體陽(yáng)性母猴所生仔猴，5～6個(gè)月齡離乳單籠關(guān)養(yǎng)，每隔1周檢測(cè)1次，共檢3次。B病毒檢測(cè)結(jié)果（見表1）。其中1只B病毒抗體為陽(yáng)性，71只B病毒抗體為陰性，陰性率為98.6%。

3討論

用人單純皰疹病毒1型（HSV-1）為抗原[6]，玻片免疫酶檢測(cè)抗體的方法，對(duì)動(dòng)物研究所動(dòng)物中心飼養(yǎng)獼猴B病毒抗體陰性動(dòng)物分區(qū)，起到了很大促進(jìn)作用。該方法方便快捷，而且普通實(shí)驗(yàn)室條件就可進(jìn)行。用該方法檢測(cè)B病毒抗體陰性動(dòng)物，得到日本食品農(nóng)醫(yī)藥品安全評(píng)價(jià)中心認(rèn)可。他們用這些動(dòng)物進(jìn)行藥理、病理試驗(yàn)。

B病毒抗體陰性482只動(dòng)物，進(jìn)行4次檢測(cè)，第1次檢出9只B病毒抗體陽(yáng)性動(dòng)物，檢出率1.88%。第2次、第3次各檢出11只，檢出率分別為2.28%、2.28%。第4次檢出12只B病毒抗體陽(yáng)性動(dòng)物，檢出率2.49%。檢測(cè)是否表明B病毒感染的動(dòng)物未排毒，因?yàn)槲覀儍H采用一種檢測(cè)方法還須進(jìn)一步證實(shí)。另外由于飼養(yǎng)環(huán)境改變和動(dòng)物健康、應(yīng)急等因素，也可能導(dǎo)致病毒活化，出現(xiàn)抗體陽(yáng)性。Weir[7]報(bào)道，B病毒潛伏感染，發(fā)生病毒活化和排毒，常不伴有臨床癥狀。感染猴子雖然從黏膜排毒，但并不經(jīng)常排泄B病毒，通常排毒時(shí)間需要幾小時(shí)。他們對(duì)常規(guī)動(dòng)物檢疫、繁殖、剖腹產(chǎn)、正常分娩等是否會(huì)引起血清陽(yáng)性猴子病毒的排泄和傳播也進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)16只血清陽(yáng)性猴仔在剖腹產(chǎn)或正常分娩后每周檢疫1次持續(xù)3周的檢疫中，也沒(méi)有排毒。

HSV-1作為抗原，用IEA和ELISA方法，對(duì)72只B病毒抗體陽(yáng)性母猴和離乳后5～6月齡單籠關(guān)養(yǎng)仔猴進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果71只B病毒抗體陰性，陰性率98.6%。表明母猴直接傳播給仔猴的幾率極低。饒軍華[8]等報(bào)道，仔猴體內(nèi)攜帶B病毒母源抗體隨著月齡變化，5月齡時(shí)B病毒水平下降至最低水平，之后病毒抗體水平逐漸上升。這也給我們提供仔猴最佳的離乳時(shí)間。采用兩種方法檢測(cè)72只仔猴和72只B病毒抗體陽(yáng)性母猴，3次檢測(cè)結(jié)果都一致，表明兩種方法都可行，用HSV-1抗原片IEA方法更簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果說(shuō)明母猴抗體陽(yáng)性垂直傳染給仔猴幾率極低。

[1]田克恭.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒性疾病[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992．

[2]賀爭(zhēng)鳴，衛(wèi)禮，鞏薇，等.猴B病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立和研究成果[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，11（3）：161-164．

[3]饒軍華，劉曉明，田克恭，等.獼猴SPF種群的建立及保持過(guò)程中B病毒抗體監(jiān)測(cè)研究[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2003，13（5）：294-296.

[4] Weigler B J，Roberts JA，Hird DW，etal.A cross sectionalsur?vey for B virus antibody of group housed rhesusmacaques[J].Lab Anim Sci，1990，40：257-261．

[5] 饒軍華，王海英，劉曉明，等.B病毒感染的預(yù)防和治療方法[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，15（4）：240．

[6]李紹東，周亞敏，段幸生，等.猴B病毒相關(guān)抗體及B病毒抗體檢測(cè)的比較研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，1995，3（2）：94-97．

[7] Weir E C，et al.Infresvirus simiae from seropositive macaques Lab Anim Sci[J].1993Dec 1；42（6）：541-544．

[8]饒軍華，劉曉明，王海英，等.人工馴養(yǎng)條件下食蟹猴B病毒抗體水平變化規(guī)律研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，17（1）：12-14．