柳舒航，韋 莉，王 菁，朱姍姍，張春燕，閻 旭，全 榮，李子璇，劉 爵

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 昌平102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀100097）

雞傳染性囊病(Chicken infectious bursal dis?ease，IBD)是由傳染性囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種危害幼雞的急性、高度接觸性傳染病。該病能破壞雞中樞免疫器官稱腔上囊，引起嚴(yán)重的免疫抑制，主要抑制體液免疫，其次是局部免疫，再次是細(xì)胞免疫[2]，并可誘發(fā)多種疾病或使多種疫苗免疫失敗。特別是近年來超強(qiáng)毒株[2]的出現(xiàn)，發(fā)病雞的死亡率大大提高，給世界各地的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給禽病工作者帶來了新的挑戰(zhàn)。

IBDV屬于雙核糖核酸病毒科，其基因組由A、B兩個(gè)片段的雙鏈RNA組合而成，其中A片段主要編碼一種前體多聚蛋白NH2-VP2-VP4-VP3-COOH[3-4]，該多聚蛋白在翻譯后進(jìn)一步加工形成VP2、VP4和VP3蛋白；B片段主要編碼VP1蛋白。其中，VP2和VP3是IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分。VP2具有血清型特異性、含有能誘導(dǎo)中和抗體的構(gòu)象依賴性抗原決定簇，是IB?DV的保護(hù)性抗原，其誘導(dǎo)的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主不受IBDV的感染。

果蠅表達(dá)系統(tǒng)（Drosophila expression system，DES）屬于真核表達(dá)系統(tǒng)中昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的一種，與昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)十分相似。DES的表達(dá)產(chǎn)物具有與天然產(chǎn)物相似的理化和生物學(xué)特性，能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的翻譯后加工修飾，同時(shí)DES同時(shí)具有昆蟲高水平表達(dá)和哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，而且表達(dá)產(chǎn)量高，適合大規(guī)模生產(chǎn)，現(xiàn)已廣泛用于多種外源基因的表達(dá)[5-6]。

本研究進(jìn)行了IBDV VP2基因的分子克隆及果蠅S2細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)，為IBDV診斷抗原、亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、菌種和載體 S2果蠅細(xì)胞系(Sch?neider 2 Cells)、果蠅系統(tǒng)表達(dá)載體pMT/BiP/V5/Hi?sA及抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro均為本實(shí)驗(yàn)室保存，菌株E.coli DH5α，購自TaKaRa公司，含有VP2蛋白基因序列的重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 PrimeSTARHSDNA Polymerase購自，TaKaRa公司；Trans2K DNA Marker，購自Trans?gen公司；快速凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒，購自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I和磷酸酶抑制劑，購自NEB公司；QIAquick PCR Purification Kit、Ni-NTA蛋白純化試劑盒，購自Qiagen公司；T4 DNA連接酶，購自Fer?mentas公司；通過小鼠腹水制備的VP2蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)、合成與PCR 根據(jù)GenBank上發(fā)表并合成的IBDV VP2基因序列，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(F1/F2)，F(xiàn)1：5′-CATG CCATGG ATGGTTAGTAGAGATCAGAC-3′，5′端加上Nco I酶切位點(diǎn)；F2：5′-AT GAATTC CTCAGGCTTCCTTG?GAAGGTCAC-3′，5′端加上EcoR I酶切位點(diǎn)。其擴(kuò)增片段長度為1 323 bp，引物由Invitrigen公司合成。

按照PCR說明書進(jìn)行常規(guī)操作。取重組質(zhì)粒作模板0.2μL，加入VP2引物F1、F2各1μL，dNTP 4μL，5×Buffer 2μL，Prime STAR 0.2μL，加ddH20至20 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)程序如下：95℃預(yù)變性5min后，以94℃30 s，55℃1.5min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳分析，參照OMEGA公司快速凝膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。

1.4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 取回收的PCR產(chǎn)物，用Nco I和EcoR I雙酶切，同樣雙酶切真核表達(dá)載體pMT/BiP/V5/HisA，并純化回收線性化載體。將線性化載體進(jìn)行去磷酸化處理，與PCR片段以適當(dāng)比例于22℃用T4連接酶連接過夜，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α宿主菌。挑選陽性克隆進(jìn)行酶切及PCR鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送Invitrogen公司測序，以確定VP2基因插入的正確性。

1.5 果蠅S2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與篩選 按照Qiagen大提質(zhì)粒試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的濃度分別為460.3μg/mL和650.5μg/mL。果蠅S2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen試劑盒說明書。將2mL含3×106的果蠅S2細(xì)胞的完全培養(yǎng)基接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，28℃無CO2溫箱培養(yǎng)過夜，直到細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長期（2～4×106/mL）。對(duì)于每一孔細(xì)胞，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑如下：A液（2mol/LCaCl236μL，重組質(zhì)粒19μg，pCoHygro 1μg，加去離子水至300μL)，B液（300μL 2×HBS）。用槍頭逐滴緩慢地將A液加入到B液中，邊加邊用吸管吹打混勻。將所得溶液于室溫孵育30min～40min，至形成沉淀。不要吹打沉淀，將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，邊加邊混勻。28℃無CO2溫箱培養(yǎng)16 h～24 h。同時(shí)，設(shè)立pMT/BiP/V5/HisA空質(zhì)粒為對(duì)照組。

第2天，離心棄去含有磷酸鈣的培養(yǎng)基，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸，28℃無CO2溫箱培養(yǎng)2 d后用含600mg/L抗生素Hygromycin B進(jìn)行篩選。每隔4 d～5 d更換新鮮的抗性培養(yǎng)基，直到抗性細(xì)胞產(chǎn)生。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的IFA鑒定 將抗性細(xì)胞及正常S2細(xì)胞以合適密度鋪到96孔板中，加入硫酸銅至終濃度500μmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，棄上清，用PBST洗3遍，固定封閉后，將VP2單抗1∶200稀釋，4℃孵育過夜，用FITC熒光二抗1∶50稀釋，37℃孵育2 h，洗板后，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 重組蛋白的純化 由于本研究中表達(dá)的重組蛋白在羧基末端帶有6×His標(biāo)簽，因此可用鎳柱親和層析純化目的蛋白。按照Qiagen純化蛋白試劑盒說明，在非變性的條件下，將誘導(dǎo)表達(dá)后的S2細(xì)胞裂解、離心，將上清通過Ni-NTA柱，收集洗脫液，測其濃度為2.029mg/mL。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將誘導(dǎo)表達(dá)后的空細(xì)胞、陽性克隆細(xì)胞離心后用PBS重懸，和純化的VP2融合蛋白一起加入load Buffer緩沖液變性10 min后，上樣跑SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行分析。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting分析 誘導(dǎo)表達(dá)后，將細(xì)胞全蛋白、表達(dá)上清及純化的VP2融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，將VP2單抗1∶4 000稀釋，HRP IgG二抗1∶8 000稀釋，進(jìn)行Western-blotting鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 應(yīng)用特異性引物對(duì)PUC57-VP2蛋白基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 VP2基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒pMT/BiP/V5/HisA-VP2的酶切與PCR鑒定結(jié)果 將重組質(zhì)粒進(jìn)行Nco I和Xho I雙酶切與PCR鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的片段（圖2、圖3）。

圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

圖3 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.3 IFA分析結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察，正常S2細(xì)胞沒有熒光，能夠穩(wěn)定表達(dá)的S2細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光（圖4）。

圖4 表達(dá)S2細(xì)胞的IFA鑒定

2.4 SDS-PAGE分析結(jié)果 對(duì)空細(xì)胞、陽性克隆細(xì)胞及純化的VP2融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（圖5）。

圖5 表達(dá)重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

圖6表達(dá)重組蛋白的Western-blotting鑒定結(jié)果

2.5 Western-blotting分析結(jié)果 利用Westernblotting對(duì)細(xì)胞全蛋白、表達(dá)上清及純化的VP2融合蛋白進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果49 kDa處有一條較深的顯色帶，說明VP2融合蛋白具有抗原活性（圖6）。

3 討論

IBDV出現(xiàn)的初期是以經(jīng)典毒株（cIBDV）為主要流行株，當(dāng)時(shí)發(fā)病率高而死亡率不高[7]，后來，相繼出現(xiàn)了抗原變異株（vIBDV）和超強(qiáng)毒株（vvIB?DV），尤其是超強(qiáng)毒株，可引起60%～100%的死亡率，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害更大，使該病的防治面臨新的困境。VP2蛋白是IBDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，更是重要的宿主保護(hù)抗原，多種變異發(fā)生在不同分離株病毒基因的這個(gè)結(jié)構(gòu)。所以進(jìn)行VP2蛋白全基因的克隆和表達(dá)能夠減少結(jié)構(gòu)的變異，從而減少或消除中和反應(yīng)[8]。

本研究進(jìn)行了IBDV VP2基因在果蠅S2細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)研究。果蠅表達(dá)系統(tǒng)使用果蠅S2細(xì)胞為表達(dá)宿主，且有多種表達(dá)載體，包括組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)載體，可以進(jìn)行重組蛋白的胞內(nèi)、分泌或連續(xù)表達(dá)，可以適應(yīng)不同的需要。在室溫下，不需要任何特殊環(huán)境，果蠅S2細(xì)胞就可以在無CO2和無血清條件下培養(yǎng)[9]，它既可以在培養(yǎng)瓶中松散半貼壁單層生長，同時(shí)也可以很好的適應(yīng)搖瓶和發(fā)酵罐的懸浮培養(yǎng)[10]。外源基因在S2細(xì)胞系一般能夠達(dá)到500～1 000個(gè)拷貝。

本試驗(yàn)中所選取的表達(dá)載體pMT/BiP/V5/HisA是一種分泌型載體，此表達(dá)載體使用果蠅金屬硫蛋白基因（MT）啟動(dòng)子。MT啟動(dòng)子是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，即使在很高的拷貝數(shù)下也可以維持低水平的本底表達(dá)。硫酸銅或氧化鎘可以解除抑制，表達(dá)MT啟動(dòng)子的下游基因。DES的表達(dá)載體均沒有果蠅細(xì)胞的篩選標(biāo)記，只能用于短期表達(dá)。要建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，必須將帶有外源基因的載體和篩選載體共轉(zhuǎn)染。常用的篩選載體有攜帶潮霉素抗性基因的pCoHygro和攜帶有滅瘟素抗性基因的pCoBlast。將篩選載體和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，即可根據(jù)宿主耐藥性選出高拷貝的細(xì)胞株。

本研究僅是初步探索了IBDV VP2基因在S2果蠅細(xì)胞中的表達(dá)情況，為更加深入地研究IBDV VP2基因的功能及其他重組蛋白的表達(dá)提供了重要參考?？傊琁BDV VP2基因在果蠅S2細(xì)胞中的成功表達(dá)為IBDV診斷抗原及基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為預(yù)防IBDV在我國的流行提供有力的檢測和預(yù)防工具。

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