王小杰，王永為，曲銀娥，李 欣△

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063009;2.承德醫(yī)學(xué)院)

siRNA轉(zhuǎn)染濃度和時間對HeLa細(xì)胞ANXA5表達(dá)的抑制作用*

王小杰1，2，王永為2，曲銀娥1△，李 欣2△

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063009;2.承德醫(yī)學(xué)院)

目的:優(yōu)化靶向ANXA5的siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的條件，為進(jìn)一步研究ANXA5低表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞生物功能的影響奠定基礎(chǔ)。方法:將靶向ANXA5的siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，設(shè)置不同的siRNA與脂質(zhì)體的比值和轉(zhuǎn)染時間，Western Blot檢測ANXA5蛋白的表達(dá)。結(jié)果:siRNA與脂質(zhì)體的比值為0.4:1時，轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞72h后，HeLa細(xì)胞ANXA5蛋白的表達(dá)水平最低，即抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論:siRNA與脂質(zhì)體的比值和轉(zhuǎn)染時間可影響HeLa細(xì)胞ANXA5的表達(dá)，存在最佳比值和轉(zhuǎn)染時間。

siRNA;HeLa細(xì)胞;ANXA5;抑制作用

膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，是膜聯(lián)蛋白家族最重要的成員之一，它在各種組織和細(xì)胞中都有分布。有研究發(fā)現(xiàn)，ANXA5在宮頸癌中的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，在宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中亦有較高表達(dá)[1-2]。因此，若能有效抑制HeLa細(xì)胞中ANXA5的表達(dá)，進(jìn)而觀察ANXA5低表達(dá)時HeLa細(xì)胞生物學(xué)功能的變化，將對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及機(jī)制研究具有重要意義。本研究通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將靶向ANXA5的siRNA轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中，通過檢測ANXA5蛋白表達(dá)的變化探討了siRNA與脂質(zhì)體的最佳比值和最佳轉(zhuǎn)染時間。

1 材料與方法

1.1 材料 靶向ANXA5的siRNA由invitrogen公司設(shè)計合成，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，鼠抗ANXA5單克隆抗體購自Epitomics公司。

1.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組:siRNA干擾組(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶向ANXA5的siRNA)、陰性對照組(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)和空白對照組(不做任何處理)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按轉(zhuǎn)染試劑說明:將1×105個細(xì)胞500μl接種于24孔培養(yǎng)板，要求細(xì)胞24h達(dá)到70%的密度。將適量siRNA及脂質(zhì)體分別溶于一定量的無血清培養(yǎng)基中，混勻后室溫放置20min以形成載體復(fù)合物，將復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 Western Blot法檢測HeLa細(xì)胞ANXA5蛋白的表達(dá) 收集各組HeLa細(xì)胞提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度。每孔加入30μg總蛋白行SDS-PAGE電泳;電轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉封閉2h;ANXA5單克隆抗體(1:1000)室溫孵育2h;TBST洗膜;羊抗鼠二抗室溫封閉1h;超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)法獲得結(jié)果;采用Quantity One-4.6.2軟件分析目的條帶與β-actin條帶的灰度比值。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和q檢驗進(jìn)行均數(shù)間差異顯著性的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA與脂質(zhì)體不同比值對HeLa細(xì)胞ANXA5表達(dá)的抑制作用 siRNA干擾組根據(jù)siRNA和脂質(zhì)體(1μl/孔)的不同比值設(shè)置4個組:干擾組1-4，siRNA與脂質(zhì)體的比值分別為0.5:1、0.4:1、0.33:1、0.29:1，轉(zhuǎn)染48h收取蛋白。結(jié)果顯示，siRNA與脂質(zhì)體的比值為0.4:1時ANXA5蛋白的表達(dá)最低，即對ANXA5的抑制作用最強(qiáng)(見圖1，表1)。

圖1 siRNA與脂質(zhì)體不同比值對ANXA5表達(dá)的抑制作用

表1 siRNA與脂質(zhì)體不同比值時各組ANXA5與β-actin的灰度值比(±s，n=8)

表1 siRNA與脂質(zhì)體不同比值時各組ANXA5與β-actin的灰度值比(±s，n=8)

與空白對照組比較:*P＞0.05;與陰性對照組比較:#P＜0.05;與其它3個干擾組比較:△P＜0.05

組別 ANXA5/β-actin干擾組1(0.5:1) 0.1250±0.3969#干擾組2(0.4:1) 0.0863±0.1097#△干擾組3(0.33:1) 0.1100±0.0100#干擾組4(0.29:1) 0.1800±0.0400#陰性對照組 0.3033±0.6505*空白對照組 0.3200±0.4648

2.2 不同轉(zhuǎn)染時間對HeLa細(xì)胞ANXA5表達(dá)的抑制作用

取siRNA與脂質(zhì)體比值為0.4:1時，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h收取蛋白。結(jié)果顯示，72h時ANXA5蛋白的表達(dá)最低，即抑制作用最強(qiáng)(見圖2，表2)。

圖2 不同轉(zhuǎn)染時間對ANXA5表達(dá)的抑制作用(siRNA:脂質(zhì)體=0.4:1)

表2 不同轉(zhuǎn)染時間時各組ANXA5與β-actin的灰度值比(±s，n=8)

表2 不同轉(zhuǎn)染時間時各組ANXA5與β-actin的灰度值比(±s，n=8)

與空白對照組比較:*P＞0.05;與陰性對照組比較:#P＜0.05;與其它3個轉(zhuǎn)染時間比較:△P＜0.05

轉(zhuǎn)染時間 ANXA5/β-actin 24h 0.8686±0.7704#48h 0.3367±0.0058#72h 0.0360±0.0069#△96h 0.0433±0.1155#陰性對照組 1.2600±0.2646*空白對照組 1.2650±0.1871

3 討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對ANXA5與惡性腫瘤的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ANXA5在鼻咽癌、喉癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸腺癌以及大腸癌等多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)都有不同程度的升高，且有研究者推斷ANXA5的異常表達(dá)可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤以及轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-8]。關(guān)于ANXA5與宮頸癌的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織ANXA5的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，且與癌細(xì)胞的分化程度具有一定的相關(guān)性[1，9];ANXA5在宮頸癌細(xì)胞系SiHa和HeLa細(xì)胞中亦表現(xiàn)為高表達(dá)，且ANXA5過表達(dá)可抑制SiHa細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，ANXA5低表達(dá)對HeLa細(xì)胞的增殖沒有明顯影響，但可抑制其凋亡[2,10-12]。以上研究結(jié)果均提示ANXA5與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，并且可能通過影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步探討ANXA5表達(dá)的改變對宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，擬采用脂質(zhì)體介導(dǎo)ANXA5 siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞來降低ANXA5蛋白的表達(dá)，但考慮到影響抑制作用的因素有許多方面，不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件不同。因次，本研究從siRNA與脂質(zhì)體的比值和轉(zhuǎn)染時間兩個方面優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件，結(jié)果顯示影響靶基因蛋白表達(dá)的因素主要有siRNA與脂質(zhì)體的比值和轉(zhuǎn)染時間，并發(fā)現(xiàn)ANXA5 siRNA與脂質(zhì)體的比值為0.4:1時，轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞72h后，對HeLa細(xì)胞ANXA5蛋白表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。本研究可為深入研究ANXA5與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

[1]李欣，高福祿，李建團(tuán)，等.膜聯(lián)蛋白A5在人子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)[J].解剖學(xué)報，2008，39(6):923-926.

[2]李欣，高福祿.ANXA5在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，25(1):12-13.

[3]李嶺，莊英幟. Annexin A5表達(dá)與鼻咽癌分化轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].腫瘤防治研究，2011，38(4):389-393.

[4]趙銳，李金穗，陳果，等.膜聯(lián)蛋白A5在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2003，19(2):98-101.

[5]吳韓梅，張淼，林健敏.膜聯(lián)蛋白A5在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(7):1097-1099.

[6]Deng S, Wang J, Hou L, et al. Annexin A1, A2, A4 and A5 play important roles in breast cancer, pancreatic cancer and laryngeal carcinoma, alone and/or synergistically [J]. Oncol Lett, 2013, 5(1):107-112.

[7]趙帥，肖琳.結(jié)腸腺癌中膜聯(lián)蛋白A5的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤學(xué)雜志，2013，19(5):378-381.

[8]邢俊杰.膜聯(lián)蛋白A5在散發(fā)性大腸癌中的表達(dá)及其與大腸癌分期及預(yù)后的相關(guān)性研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

[9]王立平，李欣，許倩，等.膜聯(lián)蛋白A5在人宮頸鱗癌不同分化型的表達(dá)及臨床意義[J].天津醫(yī)藥，2012，40(7):648-650.

[10]李欣，高福祿.膜聯(lián)蛋白A5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其過表達(dá)對SiHa細(xì)胞增殖的影響[J].解剖學(xué)報，2009，40(1):52-56.

[11]李欣，高福祿，竇志杰，等.膜聯(lián)蛋白A5過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞凋亡的影響[J].解剖學(xué)雜志，2008，31(5): 668-673.

[12]李欣，周曉春，許倩，等.膜聯(lián)蛋白A5低表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].解剖學(xué)報，2009，40(1):48-51.

INHIBITING EFFECTS OF SIRNA TRANSFECTION CONCENTRATION AND TIME ON ANXA5 EXPRESSION IN HELA CELLS

WANG Xiao-jie, WANG Yong-wei, QU Yin-e, et al
(Basic Medical Sciences of Hebei United University, Hebei Tangshan 063009, China)

Objective:To optimize the conditions of siRNA targeting ANXA5 transfected into HeLa cells, so to provide bases for further studying effects of ANXA5 low expression on biological functions of cervical cancer cells.Methods:siRNA targeting ANXA5 was transfected into HeLa cells, with different ratios of ANXA5 siRNA and liposomes, and different transfection time. Western Blot was used to detect the ANXA5 protein expression in HeLa cells.Results:The ANXA5 protein expression in HeLa cells was the lowest (the inhibitory effects was the strongest) when the ratio of siRNA and liposomes was 0.4:1 and transfection time was 72h. Conclusions:The ratio of siRNA and liposomes and transfection time can inf l uence the expression of ANXA5 in HeLa cells, and has the best ratio and transfection time.

siRNA; HeLa cells; ANXA5; Inhibiting effects

R73-3

A

1004-6879(2014)01-0015-03

2013-07-23)

* 河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(10276142)

△ 通訊作者