唐新橋，朱寶玉，王萬春

·藥理毒理·

冬凌草甲素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的研究

唐新橋1，朱寶玉1，王萬春2

目的：考察冬凌草甲素是否能誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。方法：用不同濃度的冬凌草甲素作用于MG-63細(xì)胞，用Hochest33258染色鑒定MG-63細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征；用流式細(xì)胞儀分析MG-63早期凋亡細(xì)胞的百分率；用Caspase-8蛋白印跡分析證明MG-63細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子特征。結(jié)果：凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀檢測(cè)均有力證明冬凌草甲素能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡；冬凌草甲素誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡伴有Caspase-8蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活。結(jié)論：冬凌草甲素能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。

冬凌草甲素；人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞；凋亡；分子機(jī)制

多項(xiàng)研究表明，冬凌草甲素能抑制前列腺癌[1]、乳腺癌[2]、肝癌[3]、肺癌[4]和血液系統(tǒng)腫瘤[5]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在臨床治療惡性腫瘤方面展示出良好的應(yīng)用前景。其具體作用機(jī)制尚不甚清楚，有研究認(rèn)為增殖抑制是冬凌草甲素抗腫瘤作用的重要環(huán)節(jié)之一，也有研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素抗腫瘤作用常常與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。為了解冬凌草甲素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株是否具有凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，作者在體外條件下對(duì)不同濃度冬凌草甲素干預(yù)的MG-63細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞引自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院內(nèi)分泌研究所。冬凌草甲素購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。Hochest33258染料購(gòu)自凱達(dá)生物公司。兔抗人Caspase-8抗體為StressGen 公司產(chǎn)品；ECL（Enhanced chemiluminescence）試劑盒購(gòu)自Amersham公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自BECTON DICKINSON公司。BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECTON DICKINSON公司產(chǎn)品；Lamda-Bio10型紫外分光光度計(jì)為美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品；PAC200型電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及Mini-PROTEAN II 電泳槽為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；自動(dòng)X光沖片機(jī)和膠片為美國(guó)柯達(dá)公司產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮內(nèi)取出凍存的人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞，復(fù)蘇后貼壁生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，待用。

1.2.2 Hochest33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105個(gè)/mL，接種于無菌6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。各實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的冬凌草甲素，混勻，使冬凌草甲素終濃度分別為

12.5 、25、50 μmol．L-1，對(duì)照組加等體積DMSO。48小時(shí)后，離心去液體，用冷的PBS洗兩遍，涂片，1 mL 4%的甲醛溶液4℃固定10 min，PBS洗兩遍，滴加100 μL Hochest33258工作液，室溫下放置10分鐘，沖洗干凈，自然風(fēng)干，在熒光顯微鏡下紫外光340 nm波長(zhǎng)激發(fā)觀察。立即在熒光顯微鏡下觀察并照相，鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，按以下公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率：凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%，重復(fù)3次。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105個(gè)/mL，接種于無菌6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，各實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的冬凌草甲素，混勻，使冬凌草甲素終濃度分別為12.5、25、50 μmol．L-1，對(duì)照組加入等體積DMSO。分別培養(yǎng)24和48小時(shí)后，1000 rpm離心5分鐘，棄上清后消化收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上進(jìn)行Annexin V檢測(cè)（按試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟略）。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)Caspase-8蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105個(gè)/mL，接種于無菌培養(yǎng)瓶中。各實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的冬凌草甲素，混勻，使冬凌草甲素終濃度分別為12.5、25、50 μmol．L-1，對(duì)照組加等體積DMSO。48小時(shí)后，收集細(xì)胞，按常規(guī)步驟抽提蛋白質(zhì)，Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入兔抗人Caspase-8抗體孵育，ECL試劑盒檢測(cè)液Caspase-8蛋白信號(hào)，自動(dòng)X光沖片機(jī)沖片。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 不同藥物濃度處理組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率比較采用t檢驗(yàn)分析；各種統(tǒng)計(jì)圖采用SPSS11.5 for windows及Microcoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件獲得。

2 結(jié)果

2.1 Hochest33258染色結(jié)果

對(duì)照組MG-63細(xì)胞的細(xì)胞核界限清晰，呈圓形或橢圓形，為均勻藍(lán)綠色熒光，染色質(zhì)分布均勻（圖2-1A）；冬凌草甲素處理后的細(xì)胞，部分細(xì)胞的細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)凝集呈顆粒團(tuán)狀分布，有的核碎裂形成多個(gè)球形顆粒（圖2-1B箭頭所示）。經(jīng)12.5 μmol．L-1冬凌草甲素處理后，MG-63細(xì)胞的凋亡率為12.6±1.6%，是對(duì)照組的3.8倍（凋亡率為3.3±0.8%），干預(yù)組與對(duì)照組相比差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；用濃度分別為25 μmol．L-1和50 μmol．L-1的冬凌草甲素處理后，MG-63細(xì)胞的凋亡率分別是對(duì)照組的5.3倍和7.8倍，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2-2及表2-1）。根據(jù)Hochest33258染色結(jié)果可以看出，冬凌草甲素有誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的作用，且隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率也逐漸增高。

表1 冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率(%)影響(Hochest33258染色)()

表1 冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率(%)影響(Hochest33258染色)()

注：與對(duì)照組比較，* P＜0.05；* *P＜0.01

干預(yù)時(shí)間 對(duì)照組 12.5 μmol．L-125 μmol．L-150 μmol．L-148hr 3.3±0.8 12.6±1.6* 17.3±1.9* 26.0±2.5 **

圖1 正常細(xì)胞和50 μmol．L-1冬凌草甲素干預(yù)后MG-63細(xì)胞Hochest33258染色結(jié)果（×400）

圖2 不同濃度冬凌草甲素處理后MG-63細(xì)胞的凋亡率：Hochest33258染色(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

2.2 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)MG-63細(xì)胞早期凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG-63細(xì)胞的早期凋亡率結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素（0，12.5，25，50 μmol．L-1）干預(yù)48小時(shí)后，MG-63細(xì)胞的早期凋亡率分別為3.94%±0.92%，13.242%±2.32%，18.87%±3.19%和25.33%±3.86%，即隨著藥物濃度的增加，MG-63細(xì)胞的早期凋亡率也逐漸增加，且差異明顯（P＜0.05）；在相同的藥物濃度下，對(duì)照組24小時(shí)的早期凋亡率為3.65%±0.82%，12.5 μmol．L-1組為8.25%±2.54%，25 μmol．L-1組為10.72%±2.98%，50 μmol．L-1組為14.12%±3.63%?？梢娫谙嗤乃幬餄舛认拢?4小時(shí) MG-63細(xì)胞的早期凋亡率明顯低于48小時(shí)，尤其是25 μmol．L-1組與50 μmol．L-1組，差異非常顯著（P＜0.01）（表1及圖1，圖2），由此可見冬凌草甲素誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞早期凋亡呈時(shí)間和濃度依賴性。

圖3 不同濃度冬凌草甲素處理后MG-63細(xì)胞的早期凋亡率：Annexin V-FITC/PI染色

冬凌草甲素分別干預(yù)24 hr和48 hr后，隨著藥物濃度的提高，MG-63細(xì)胞的早期凋亡率逐步增加；在相同濃度的藥物干預(yù)下，MG-63細(xì)胞48 hr的早期凋亡率明顯高于24 hr，即MG-63細(xì)胞的早期凋亡率表現(xiàn)出對(duì)冬凌草甲素的濃度與時(shí)間的依賴性。

表2 冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞早期凋亡率(%)影響(Annexin V-FITC/PI染色)()

表2 冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞早期凋亡率(%)影響(Annexin V-FITC/PI染色)()

注：在同一時(shí)間內(nèi)，與對(duì)照組比較，* P＜0.05；* *P＜0.01 ；在同一濃度內(nèi)，48 hr 的細(xì)胞凋亡率與24hr 的比較，▲P＜0.05

干預(yù)時(shí)間 對(duì)照組 12.5 μmol．L-125 μmol．L-150 μmol．L-124hr 3.65±0.82 8.25±2.54 10.72±2.98 * 14.12±3.63 * 48hr 3.94±0.92 13.242±2.32 * 18.87±3.19*▲25.33±3.86 **▲

圖4 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)48小時(shí)后冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞早期凋亡率的影響

四格中右下格代表膜完整的凋亡細(xì)胞數(shù)，右上格代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞數(shù)，左下格代表正?；罴?xì)胞數(shù)，左上格代表消化、收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞數(shù)。與對(duì)照組相比，隨著冬凌草甲素濃度增加，MG-63細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞數(shù)、晚期凋亡細(xì)胞和壞死的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。

2.3 Western印跡檢測(cè)Caspase-8蛋白表達(dá)的結(jié)果

從Western印跡可以看出（見圖5），對(duì)照組與12.5 μmol．L-1冬凌草甲素處理組的Caspase-8蛋白表達(dá)較微弱，但無裂解激活；從25 μmol．L-1濃度開始到50 μmol．L-1濃度，Caspase-8表達(dá)逐步上調(diào)，并且出現(xiàn)裂解激活片段。上述結(jié)果提示，冬凌草甲素可以濃度依賴性方式使Caspase-8表達(dá)上調(diào)和裂解激活，冬凌草甲素誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡涉及到Caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

圖5 冬凌草甲素誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡伴Caspase-8蛋白表達(dá)上調(diào)及裂解激活的Western印跡結(jié)果

1-4泳道分別代表0、12.5 μmol．L-1、25 μmol．L-1和50 μmol．L-1的冬凌草甲素濃度組。

3 討論

為了解冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞是否具有凋亡誘導(dǎo)作用，作者通過對(duì)藥物作用后的MG-63細(xì)胞進(jìn)行Hochest33258染色分析和流式細(xì)胞儀分析，以證明凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。將膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）與碘化丙啶（Propidine iodide, PI）匹配使用，可以把凋亡早晚期的細(xì)胞和已經(jīng)死亡的細(xì)胞區(qū)分開來：正常細(xì)胞Annexin V-FITC和PI染色均為陰性，早期凋亡階段的細(xì)胞Annexin V-FITC陽性而PI陰性，晚期凋亡階段和已經(jīng)死亡的細(xì)胞Annexin V-FITC和PI染色均為陽性[7～9]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的冬凌草甲素干預(yù)MG-63細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素干預(yù)不同時(shí)間后，隨著藥物濃度的升高和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞早期凋亡率逐漸增加；冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞早期凋亡的誘導(dǎo)呈時(shí)間和濃度依賴性。為進(jìn)一步研究冬凌草甲素凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，作者同時(shí)用Hochest33258染色方法對(duì)MG-63細(xì)胞晚期凋亡進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，冬凌草甲素處理后的細(xì)胞，部分細(xì)胞的細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)凝集呈顆粒團(tuán)狀分布，有的核碎裂形成多個(gè)球形顆粒，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)證明冬凌草甲素有誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的作用。由此可見，Annexin V-FITC和PI染色以及Hochest33258染色分析兩種實(shí)驗(yàn)方法均有力證明冬凌草甲素可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈劑量和時(shí)間依賴性。

死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在凋亡的激活過程中具有重要作用，該途徑又可分為內(nèi)源性和外源性兩條途徑：內(nèi)源性死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)作用于死亡途徑的受體，下傳信號(hào)，激活Caspases；外源性死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)直接作用于線粒體，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspases。Caspases裂解激活后，最終作用是將DNA降解為180-200bp及其整數(shù)倍的片段，故Caspases在凋亡過程中處于中心地位。Caspase-8是凋亡的啟動(dòng)子，能夠通過寡聚而自身切割活化，并能激活下游Caspases，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)，其表達(dá)和裂解激活是反應(yīng)凋亡啟動(dòng)和發(fā)生的分子標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)中，作者用靈敏度很高的Western印跡分析了Caspase-8裂解激活情況。結(jié)果清楚的顯示，12.5 μmol．L-1的冬凌草甲素組即可上調(diào)Caspase-8蛋白表達(dá)，25 μmol．L-1的冬凌草甲素組開始出現(xiàn)裂解激活，隨著冬凌草甲素濃度的增加，Caspase-8的裂解激活也越明顯，呈現(xiàn)明顯的藥物濃度依賴性活化。以上證據(jù)清楚的表明，冬凌草甲素在誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的同時(shí)可伴有Caspase-8的表達(dá)上調(diào)和裂解激活，并呈藥物濃度依賴性；冬凌草甲素誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及到Caspase-8活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

本研究通過凋亡形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等不同角度證實(shí)了冬凌草甲素對(duì)MG-63細(xì)胞具有顯著的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并呈濃度依賴性，提示冬凌草甲素通過誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡而具有抗骨肉瘤效應(yīng)，這為冬凌草甲素用于骨肉瘤的治療提供了有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Apoptosis-inducing effect of Oridonin on Osteosarcoma MG-63 cells

TANG Xin-qiao1, ZHU Bao-yu1, WANG Wan-chun2// (1. Orthopedics, Xiangtan Central Hospital, Xiangtan 411100, Hunan; 2. Orthopedics, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan)

Objective:To investigate the effect of oridonin on the apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells.Method:After MG-63 cells were incubated with different concentrations of Oridonin, the morphologic character of apoptosis was evaluated by Hochest33258 staining. The percentage of earlier apoptosis cell was analyzed by flow cytometry. The molecular character of apoptosis was analyzed by Western blot detecting Caspase-8 expression.Result:Hochest33258 staining and fow cytometry detection powerfully testifed that Oridonin could induce the apoptosis of MG-63 cells in a concentration-dependent way. The apoptosis of MG-63 cells induced by Oridonin was found to be companied with up-regulation and cleavage of Caspase-8.Conclusion:Oridonin can induce the apoptosis of MG-63 cells with a concentration-dependent manner.

Oridonin；osteosarcoma MG-63 cells；apoptosis；molecular mechanism

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-006-04

1.湘潭市中心醫(yī)院骨科，湖南 湘潭 411100；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410011

唐新橋（1965-），男，湖南邵陽人，漢族，博士，主任醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷、腫瘤的醫(yī)療與研究 Email:Zhubaoyu101@163.com

2013-11-20