陳詩(shī)晴，蒲沁琳，陳小軍，宋瑱

·品種品質(zhì)·

基于ITS序列分析技術(shù)鑒定川牛膝與常見(jiàn)偽品麻牛膝

陳詩(shī)晴1，蒲沁琳1，陳小軍2，宋瑱1

目的：比較川牛膝與其常見(jiàn)偽品麻牛膝之間的ITS序列差異及規(guī)律。為川牛膝與麻牛膝的DNA條形碼鑒別提供適合的分子標(biāo)記。方法：收集川牛膝及麻牛膝成品藥材并提取純化其基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到ITS序列（包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2）并進(jìn)行T-A克隆后測(cè)序，分析兩者序列差異。結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得兩者ITS序列，經(jīng)多序列對(duì)比分析得出川牛膝與偽品麻牛膝的ITS序列存在明顯差異。結(jié)論：ITS序列分析可以用作鑒定川牛膝與麻牛膝藥材。

川牛膝；麻牛膝；PCR；ITS序列；DNA測(cè)序

中藥材川牛膝是莧科植物川牛膝（Cyathμla officinalis Kuan）的干燥根，為《中華人民共和國(guó)藥典》1990年版收載，是四川省著名的道地藥材，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋等功能[1,2]。近年來(lái)，現(xiàn)代藥理研究證明川牛膝多糖成分具有抗腫瘤、抗生育等新的作用[3]，使其再次受到關(guān)注。但是與川牛膝同科植物的麻牛膝入藥部位外觀與川牛膝相似，用傳統(tǒng)鑒別方法（如外觀、形態(tài)、質(zhì)地等）很難準(zhǔn)確地把兩種藥材區(qū)別開(kāi)來(lái)；中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為麻牛膝的性味功效與川牛膝不同，不宜作川牛膝藥用。因此，如何簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確地鑒定川牛膝的真?zhèn)问俏覀儚V泛應(yīng)用道地藥材川牛膝面臨的最大難題。

ITS序列是真核生物細(xì)胞基因組中的核糖體rRNA基因的轉(zhuǎn)錄間隔序列。18S nrDNA序列、ITS1間隔序列、5.8S nrDNA序列、ITS2間隔序列和26S nrDNA依次緊密連接在一起，形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位是典型的高度重復(fù)序列，在植物基因組中拷貝數(shù)可達(dá)500～40000。在技術(shù)上易于擴(kuò)增，其中的ITS1序列和ITS2序列的可變性與物種遺傳關(guān)系密切，成為了眾多研究者對(duì)于藥用植物的鑒別，揭示藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種的道地性的新方法和手段[4～7]。

圖1 ITS完整序列示意圖

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥材樣品 分別從四川雅安天全縣、西昌、寶興等地采集川牛膝藥材10份，西昌會(huì)理采集及成都藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)麻牛膝藥材5份。道地藥材為雅安川牛膝GAP基地產(chǎn)品。采集后置于干燥環(huán)境保存。

1.1.2 主要試劑 CTAB、Tris、蛋白酶K購(gòu)自sigma公司；HOTSTART taq DNA聚合酶，pEASY-T5 zero質(zhì)粒載體購(gòu)自北京全式金公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京博邁德公司，磁珠法細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及擴(kuò)增引物購(gòu)自上海生工公司。

表1 擴(kuò)增引物及其序列

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA分離純化 采用本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)改良后的磁珠法提取，以75%酒精消毒川牛膝及麻牛膝藥材，剔去表面后液氮研磨成粉末，10%CTAB/NaCl裂解液裂解樣品粉末后加入吸附性磁珠。以磁力架吸附包含DNA的磁珠，加入70%的乙醇洗滌磁珠，揮干乙醇后加入50μL洗脫液洗脫獲得基因組DNA。將獲得的DNA用0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，紫外分光光度儀檢測(cè)OD260值計(jì)算濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增ITS序列 參照NCBI上牛膝屬I(mǎi)TS完整序列（包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2，GenBank: DQ497186.1）設(shè)計(jì)引物ITS1及ITS4。以上一步所得的DNA為模板構(gòu)建川牛膝ITS序列PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×Buffer，200mM dNTP，0.25uM引物，1U HOTSTART taq DNA聚合酶，100ng模板，補(bǔ)超純水至50μL。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒；52℃退火30秒；72℃延伸1分鐘；循環(huán)30次后72℃延伸7分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的T-A克隆及序列分析 將PCR產(chǎn)物經(jīng)紫外分光定量后按摩爾比7: 1加入pEASY-T5 zero質(zhì)粒載體，25℃連接10分鐘，42℃熱激30秒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素（100mg/L）的SOC平板上培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行菌落PCR篩選，獲得陽(yáng)性克隆。將篩選后的陽(yáng)性克隆送上海生工公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 川牛膝及麻牛膝藥材（根莖）的基因組DNA的鑒定

取“1.2.1”中獲得牛膝藥材DNA溶液5μL上樣于0.7%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。圖中可以分析出DNA分子完整，無(wú)明顯降解，且濃度較高，可以滿足下游PCR實(shí)驗(yàn)。紫外分光檢測(cè)A260/A280均為1.7-2.0范圍內(nèi)，無(wú)明顯蛋白污染。

圖2 川牛膝及麻牛膝基因組DNA的電泳鑒定結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增ITS序列的電泳結(jié)果

以1.2.2方法擴(kuò)增16份樣品ITS序列經(jīng)電泳檢測(cè)均獲得明顯的特異性產(chǎn)物，大小670bp。見(jiàn)圖3。

圖3 川牛膝及麻牛膝ITS序列PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.3 川牛膝及麻牛膝ITS序列測(cè)序結(jié)果分析

經(jīng)測(cè)序后，參照NCBI中莧科植物ITS序列經(jīng)BlAST比對(duì)，以及DNAMAN軟件多序列分析，確定11株川牛膝ITS序列長(zhǎng)度約為591bp，G+C%約為53.3-53.7%。其中ITS1序列約232bp、5.8S nrDNA序列約162bp、ITS2序列約197bp。5株麻牛膝ITS序列長(zhǎng)度約為587bp，G+C%約為51.6-52.1%。其中ITS1序列約230bp、5.8S nrDNA序列約162bp、ITS2序列約195bp。所有樣品5.8S nrDNA序列都高度保守，ITS1及ITS2序列在同種間只有少量差異，在川牛膝與麻牛膝間有明顯的差異30余處，見(jiàn)圖4。

圖4 川牛膝及麻牛膝ITS序列差異對(duì)比分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本次研究對(duì)于樣品的采樣部位是成品藥材即根莖部位，而由于植物根莖的DNA分離純化難度較高，所以現(xiàn)有眾多研究者采樣部位主要是采用了新鮮葉片提取DNA，方法以CTAB法為主[8,9]。但此方法不適合對(duì)藥材成品的DNA提取。本研究采用了優(yōu)化后的磁珠法。磁珠法提取生物樣本DNA在方法上有快速、樣品純度及濃度高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于植物根莖的細(xì)胞裂解不及CTAB法效率高。本次研究綜合利用磁珠法和CTAB法的優(yōu)點(diǎn)，先利用CTAB裂解液處理樣品裂解細(xì)胞，再使用磁珠法收集純化DNA，獲得了良好的效果。

對(duì)11株川牛膝及5株麻牛膝ITS序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在同種的川牛膝ITS序列中5.8S nrDNA序列高度保守，未發(fā)現(xiàn)有突變位點(diǎn)，ITS1及ITS2序列在隨產(chǎn)地不同只有少數(shù)幾個(gè)堿基有差異，道地藥材和其余10株不同產(chǎn)地川牛膝沒(méi)有明顯穩(wěn)定的差異。所以，ITS序列分析不能用作鑒別川牛膝道地藥材，需要另尋其他分子標(biāo)記。

在川牛膝和麻牛膝不同種牛膝間發(fā)現(xiàn)，其ITS1及ITS2序列在42位、50位、88位、90位等30多處位點(diǎn)有明顯的堿基替換、缺失、插入等差異。并且這些差異具有較好的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)重復(fù)雙向測(cè)序驗(yàn)證，這些結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)ITS序列測(cè)序后經(jīng)過(guò)序列比對(duì)能較好的反映出川牛膝和麻牛膝的分子差異。因此可利用這種技術(shù)鑒定川牛膝和麻牛膝藥材。

[1] 張敬杰,蘆衛(wèi)紅,史旭霞.牛膝的草本學(xué)研究[J].現(xiàn)代中西結(jié)合雜志,1994,7(11):696.

[2] 胡世林.中國(guó)道地藥材論叢[M].北京:北京中醫(yī)古籍出版社, 1997:62.

[3] 陳紅,劉友平.川牛膝多糖抗腫瘤作用初探[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,24(1):16.

[4] Gottschling M,plotner J.plotner.Secondary structure models ofthe nuclear intemal -transcribed spacer regions and 5.8S rRNA in CaleiodinelIoideae(Peridiniaeeae) and other dinofagellates[J].Nucleic Acids Res,2004,32(1):307．

[5] Baldwin BG,Sandersonm J,Porter JM．TheITSIegion of nuclear ribosomal DNA:A valuable soμl'ce of evidence on angiosperm phylogeny[J].Ann Missouri Bot Gard,1995,82:247.

[6] Hyosig Won,Susanne S,Renner.The internal transcribed spacer of nuclear ribosomal DNA in the gymnosperm Gnetum[J]. Molecμlar Phylogenetics and Evolution,2005,36:581.

[7] 趙歡,吳衛(wèi).核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(4):959.

[8] 丁平,方琴.巴戟天與常見(jiàn)混偽品的rDNA-ITS序列分析及其分子鑒定[J].中草藥,2005,36(6):908.

[9] 趙永亮,傅體華. 川牛膝(Cyathula oficinalis Kuan)RAPD和AFLP標(biāo)記的多態(tài)性聚類分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,36(16): 6682.

（責(zé)任編輯：蔣淼）

The identifcation of Chuanniuxi and adulterants Maniuxi based on ITS sequence analysis

CHEN Shi-qing1,PU Qinglin1,CHEN Xiao-jun2,SONG Zhen1//(1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137;2. Sichuan Lu Tian Hua Co., Ltd. Luzhou 646300)

Objective:To fnd the difference of ITS sequences and regularity between Chuanniuxi and its common adulterants Maniuxi, and provide suitable molecular markers for the DNA barcoding identification of Chuanniuxi and Maniuxi. Method:The samples of Chuanniuxi and Maniuxi were collected, and genomic DNA were extracted to get the ITS sequences by PCR amplification (including ITS1, 5.8S nrDNA and ITS2). Then ITS sequence and sequence divergence were analyzed after T-A cloning.Result:The ITS sequence were got after PCR amplifcation and signifcant differences between Chuanniuxi and Maniuxi was found by multiple sequence alignment analysis. Conclusion:ITS sequence analysis can be used to identify the raw material Chuanniuxiu and Maniuxi.

Chuanniuxi; Maniuxi; PCR; ITS sequences; DNA sequence analysis

R 282.5

A

1674-926X(2014)04-002-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(編號(hào)ZRYB2010)；成都中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生科研實(shí)踐創(chuàng)新課題（編號(hào)2012-90）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都611137；2.四川省瀘天化股份有限公司中化室，四川 瀘州 646300

陳詩(shī)晴（1993-），女，本科，成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)專業(yè)Tel: 18215525190 Email:502590353@qq.com

宋瑱（1979-），男，醫(yī)學(xué)碩士，主管檢驗(yàn)技師，主要從事醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究Email:red_cell@qq.com

2013-10-24