趙貴明，劉 洋，陳 穎，楊海榮，趙勇勝，王 娉

克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫的建立及應(yīng)用

趙貴明，劉 洋，陳 穎*，楊海榮，趙勇勝，王 娉

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)建立了克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫，用于該菌屬內(nèi)種和亞種的高通量鑒定及菌株分型。在優(yōu)化培養(yǎng)條件、樣品處理方法及確定MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜采集參數(shù)的基礎(chǔ)上，將采集的8 種參考菌株蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Biotyper軟件構(gòu)建克羅諾桿菌的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫，再用相近腸桿菌及該屬分離株驗證數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：應(yīng)用建立的克羅諾桿菌的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫對135 株克羅諾桿菌分離株進行分析，鑒定分值均不小于2.0，達到了種水平鑒定要求，通過聚類分析，可進一步分型。構(gòu)建的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫為克羅諾桿菌高通量鑒定與分型提供了一種新的手段。

克羅諾桿菌；MALDI-TOF-MS；數(shù)據(jù)庫；鑒定；分型

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）原名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）[1]，是一種革蘭氏陰性食源性條件致病菌[2]，廣泛存在于人和動物腸道、土壤、水及日常食品中[3]，極易污染嬰幼兒乳粉，引起早產(chǎn)兒、新生兒腦膜炎、致死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥等疾病[4-5]。鑒于該種菌表現(xiàn)出的生物多樣性，2008年Iversen等[6]根據(jù)最新實驗結(jié)果建議將阪崎腸桿菌重新劃分為一個新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），屬下包括1 個基因種（C. genomospecies）、5 個新種，分別為阪崎克羅諾桿 菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C. malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）、穆汀斯克羅諾桿菌 （C. muytjensii）、都柏林克羅諾桿菌（C. dubli nensis），其中都柏林克羅諾桿菌包括3 個亞種，分別為都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種（C. dublinensis subsp. dubl i nensi s）、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種（C. dublinensis subsp. lactaridi）和都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種（C. dublinensis subsp. lausannensis）。目前鑒定克羅諾桿菌的方法包括生化反應(yīng)方法[7]、分子生物學(xué)方法（普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測[8]、實時PCR檢測[9]、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增）等[10]，但是傳統(tǒng)的生化方法耗時長、操作繁瑣；分子檢測方法雖靈敏但獲得結(jié)果至少需要4 h?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionisation timeof-f l ight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近些年新發(fā)展起來的鑒定微生物的新方法[11]，不僅用于不同領(lǐng)域中微生物的鑒定[12-14]，還用于微生物的分析[15-16]。在微生物鑒定方面，它不同于傳統(tǒng)生化方法需通過觀察細菌生長過程中對糖醇類物質(zhì)的利用情況得出鑒定結(jié)果，也無需像分子生物學(xué)方法那樣先提取核酸，再進行擴增才能獲得鑒定結(jié)果，可以將待鑒定細菌培養(yǎng)物直接點在靶板上，通過檢測微生物的特征性生物標(biāo)識物（主要集中在2～20 kD，受生長環(huán)境和狀態(tài)影響很小的持續(xù)高表達蛋白），獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行比較，一個樣品從菌落到取得結(jié)果只需5 min，1.5 h可以分析約100 個樣品，從而實現(xiàn)對微生物的快速、準(zhǔn)確鑒定[17]。已商業(yè)化的用于細菌鑒定的MALDITOF-MS不僅操作方法簡單、通量大、重現(xiàn)性高，而且配備了相應(yīng)的細菌鑒定數(shù)據(jù)庫[18]，但是，由于克羅諾桿菌分類學(xué)發(fā)生變化，目前的數(shù)據(jù)庫沒有與重新分類的克羅諾桿菌屬相匹配的分析數(shù)據(jù)庫，本實驗擬利用Biotyper軟件應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集分析克羅諾桿菌屬蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，解決克羅諾桿菌的快速鑒定與分型問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

表1 參考菌株Table 1 Reference strains

共174株菌株，均來自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院微生物菌種保藏管理中心（Inspection & Quarantine Culture Collection，IQCC），參考菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)、德國微生物和細胞培養(yǎng)物集存庫（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）和英國國家模式培養(yǎng)物集存庫（National Collection of Type Cultures，NCTC），135 株克羅諾桿菌分離菌株均經(jīng)過SN/T 1632—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法》第1部分：分離與計數(shù)方法、第3部分：熒光PCR方法驗證，實驗菌株信息見表1和表2。

表2 克羅諾桿菌分離菌株Table 2 Cronobacter spp. isolates

1.1.2 試劑

甲酸（formicacid，F(xiàn)A）、乙腈（acetonitrile，ACN）和無水乙醇（色譜純） 美國Fisher公司；三氟乙酸（trifluoracetic acid，TFA）（色譜純） 德國Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，HCCA） 德國Bruker公司；腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion medium，BHI）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）和營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA） 美 國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AutoflexIII生物質(zhì)譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件的確定

將克羅諾桿菌的模式菌株阪崎克羅諾桿菌ATCC29544分別接種于TSA、NA兩種培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18、24、48 h。將不同培養(yǎng)條件下采集的ATCC29544質(zhì)譜圖與MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫相比對，獲得最高匹配度鑒定結(jié)果、譜圖基線平滑、信噪比高、蛋白質(zhì)峰多的條件為最佳培養(yǎng)條件。

1.3.2 樣品處理方法的確定

直接涂抹法：用無菌棉棒直接挑取單菌落，涂于樣品靶板上，室溫條件下晾干，再覆蓋1.0 μL基質(zhì)溶液，晾干后進行質(zhì)譜分析。

甲酸-乙腈提取法：挑取適量（約5～10 mg）菌落樣品于1.5 mL離心管中，加入300 μL純凈水，混勻，再加入900 μL無水乙醇，混勻；12 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加入50 μL 70%甲酸，仔細混勻，再加入50 μL乙腈，仔細混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取1 μL上清液點在靶板上，自然晾干后再點1 μL基質(zhì)覆蓋，晾干后進行質(zhì)譜分析。

1.3.3 培養(yǎng)基對質(zhì)譜圖背景信號的影響

選取兩種培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時間下無微生物生長的區(qū)域，用無菌棉拭子接觸培養(yǎng)基表面進行取樣，后續(xù)處理方法相同，然后進行質(zhì)譜分析。

1.3.4 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)采集

儀器參數(shù)：Smartbeam激光器；波長355 nm；每個樣品譜圖累積400 個激光脈沖信號；質(zhì)量范圍m/z 2～20 kD；延遲提取時間200 ns；加速電壓20 kV；提取電壓18.6 kV；聚焦電壓6.5 kV。每個樣品采集30 張蛋白質(zhì)量圖譜，以獲得可靠鑒定結(jié)果。

1.3.5 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫建立

選擇最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)8 株參考菌株，每株參考菌株選3 個菌落作為平行試樣，每個平行試樣重復(fù)點樣3 次，每個靶點單獨采集8 張蛋白質(zhì)量圖譜，每個平行試樣選取1 個靶點作為最終采集數(shù)據(jù)（盡量消除因樣品制備可能帶來的影響），每個參考菌株共收集24 張質(zhì)譜圖，每張質(zhì)譜圖都與Biotyper軟件中的數(shù)據(jù)庫比對，鑒定結(jié)果均為克羅諾桿菌，再通過Biotyper軟件，將采集的質(zhì)量圖譜匯總生成克羅諾桿菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.6 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫驗證

將28 株腸桿菌科其他菌、1 株糞腸球菌、1 株金黃色葡萄球菌、1 株單增李斯特氏菌和135 株克羅諾桿菌屬分離株，采用相同培養(yǎng)條件進行質(zhì)譜分析，用Biotyper數(shù)據(jù)庫和自建克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫獲得鑒定分值，根據(jù)分值驗證克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性。

1.3.7 MALDI-TOF-MS結(jié)果判定

所采集的質(zhì)譜圖與Biotyper軟件中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對，鑒定分值≥2.0表示可鑒定到種水平，其中2.300～3.000之間表示菌種鑒定的可信度較高，在1.700～1.999之間表示可屬鑒定到屬，在0.000～1.699之間表示不可信的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)條件的確定

微生物在不同的培養(yǎng)基中攝取不同的營養(yǎng)物質(zhì)，因此生長特性也各異；培養(yǎng)時間的長短也會影響微生物的生長狀態(tài)[19]。阪崎克羅諾桿菌ATCC29544在NA、TSA兩種培養(yǎng)基上生長狀態(tài)均良好，不同培養(yǎng)時間所獲得的質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫的匹配值均在2.3以上，但在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h時獲取的蛋白指紋圖譜與其他培養(yǎng)條件的相比，相對峰強度高、信噪比高、離子峰多，因此，確定最佳培養(yǎng)條件為在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h。見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)條件對阪崎克羅諾桿菌（ATCC29544）蛋白指紋圖譜的影響Fig.1 Effect of different culture conditions on protein mass spectrometric profiles of C. sakazakii

2.2 樣品最適處理方式的確定

仍以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544作為實驗菌株，在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h之后分別用直接涂抹法和甲酸-乙腈法對樣品進行處理。由圖2可知，兩種方法所得圖譜中蛋白離子峰的強度一致，但甲酸-乙腈法所得圖譜的離子峰信噪比較高，系統(tǒng)可標(biāo)識出更多的離子峰，包含了更多的蛋白標(biāo)志物，這可能是因為甲酸-乙腈法中水和乙醇能洗掉培養(yǎng)基內(nèi)的雜質(zhì)[20]，兩種溶劑混合作用將菌體表面和細胞內(nèi)的高峰強度的蛋白提取出來，最終選擇甲酸-乙腈法為樣品最適處理方式。見圖2。

圖2 不同處理方法對細菌蛋白指紋圖譜的影響Fig.2 Effect of different sample treatments on protein mass spectrometric profiles

2.3 培養(yǎng)基對質(zhì)譜圖信號的影響

選取不同培養(yǎng)條件下未生長微生物的區(qū)域進行蛋白質(zhì)量圖譜的采集，單純的培養(yǎng)基峰信號集中在m/z 2 000～4 000之間，峰強度在100～500之間，與微生物蛋白質(zhì)峰相比，這些峰信號不在微生物的離子峰中，且相對峰強度低，因此培養(yǎng)基本身不影響MALDI-TOF-MS對微生物蛋白質(zhì)量圖譜的采集（圖略）。

2.4 克羅諾桿菌模式菌株MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫的建立

使用Biotyper軟件將已采集的8 株克羅諾桿菌參考菌株的蛋白質(zhì)量圖譜匯總，建立克羅諾桿菌參考菌株的標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜。每株克羅諾桿菌參考菌株共采集70個離子峰，以75%出現(xiàn)的離子峰為屬特有離子峰，與數(shù)據(jù)庫中陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌（生物學(xué)特性與克羅諾桿菌相似）的離子峰相比對，得到6個不同離子峰：m/z 3 366.3±0.6、3 413.8±1.2、3 537.6±1.7、4 385.9±0.9、4 623.7±3.0、4 697.9±0.7，作為判別克羅諾桿菌屬的參考生物標(biāo)識物。以37.5%出現(xiàn)的離子峰為種特有離子峰，得到23 個種特有的離子峰：m/z 3 064.9、3 156.2、3 243.25±2.0、3 275.7±0.5、3 299.5±1.5、3 352.7±0.5、3 463.4、3 564.3、3 675.7、3 795.3±0.9、4 613.9±0.6、5 553.1、5 799.2、5 855.1、6 535.8、6 548.6、7 022.1±0.7、7 036.2±0.4、7 233.6、8 081.2、9 225.0±0.7、9 234.3±1.2、9 249.8±0.8，可區(qū)分克羅諾桿菌屬內(nèi)不同種以及同一種內(nèi)的不同亞種[21]?？肆_諾桿菌參考菌株MALDITOF-MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換出的蛋白質(zhì)譜條碼見圖3。

圖3 8株克羅諾桿菌參考菌株MALDI-TOF蛋白質(zhì)譜條碼Fig.3 MALDI TOF protein mass spectral barcodes of 8 reference strains of Cronobancter spp.

2.5 MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫的驗證

采用所構(gòu)建的克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫分析31 株腸桿菌科其他菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量，所得分值均小于1.7，而與Biotper數(shù)據(jù)庫相比較，鑒定分值均不小于2.0，鑒定結(jié)果與預(yù)期相同（表1）。該結(jié)果表明所建立的克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫能夠用于克羅諾桿菌屬和種水平的鑒定。

2.6 MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫對克羅諾桿菌分離株的鑒定與分型

采用所建立的克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫對135 株克羅諾桿菌分離株進行了鑒定。結(jié)果表明所有被測菌株均能鑒定到種的水平，其中阪崎克羅諾桿菌101 株、克羅諾桿菌基因種12 株、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌9株、都柏林克羅諾桿菌7 株、蘇黎世克羅諾桿菌4 株、穆汀斯克羅諾桿菌2 株。

圖4 135株克羅諾桿菌的聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram for 135 strains of Cronobancter spp.

將135 株克羅諾桿菌分離菌株的蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜進行聚類分析（圖4），選擇相似度0.8的差異水平時，可被分為6 類，用a～f類群表示，a類有5 株；b類有26 株，其中2 株來源于乳粉，1 株來源于香芋奶棒，1 株來源于凍熟辣粉整肢蝦，1 株來源于出口紅燒牛肉面；c類有9 株，其中3 株來源于洋蔥圈，1 株來源于乳粉；d類有24 株，其中2 株來源于乳粉，1 株來源于洋蔥圈，1 株來源于凍熟辣粉整肢蝦；e類有8 株，其中4 株來源于乳粉，1 株來源于辣粉整肢蝦，1 株來源于環(huán)境；f類有63 株，其中25 株來源于乳粉，4 株來源于工廠終產(chǎn)品，3 株來源于方便面。根據(jù)以上分析，樣品菌株的分型與其對應(yīng)的來源及種類并無明顯對應(yīng)關(guān)系，說明克羅諾桿菌在自然界的分布為隨機分布。

3 討 論

基質(zhì)、培養(yǎng)條件、菌體處理方法被認為是影響MALDI-TOF-MS分析微生物的3 個主要因素。在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面，NA、TSA兩種培養(yǎng)基對克羅諾桿菌屬的蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果沒有明顯影響，這說明克羅諾桿菌對生長條件的要求較為寬泛，但從譜圖中可以看出從兩種培養(yǎng)基上生長的克羅諾桿菌獲得的質(zhì)譜圖的特征峰強度和數(shù)量方面略有差異，因此，要根據(jù)待鑒定菌株的實際情況選擇最佳的培養(yǎng)條件。在實驗樣品處理方面，直接涂抹法快速易操作，但易受菌體其他代謝物干擾；甲酸-乙腈提取法可以將細菌內(nèi)部和表面的蛋白質(zhì)提取出來，盡管本實驗兩種方法所得圖譜中蛋白離子峰的強度一致，但甲酸-乙腈法所得圖譜的離子峰的信噪比較高，包含了更多的蛋白標(biāo)志物。

趙貴明等[22]曾用MALDI-TOF-MS對32 株克羅諾桿菌進行過與分型實驗，鑒定到種、屬水平分別為56.2%和37.5%，在實驗中提出了利用Biotyper開放型數(shù)據(jù)庫的特點建立克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫以提高克羅諾桿菌種鑒定水平的建議[23]，本實驗將135 株克羅諾桿菌全部鑒定到種水平的結(jié)果說明，通過自建數(shù)據(jù)庫是提高鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的方法之一。通過對鑒定菌株蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜聚類分析，選擇不同差異水平，可以在種以下對菌株進一步分型，這對克羅諾桿菌的快速溯源具有重要參考價值。

MALDI-TOF-MS除用于常規(guī)細菌的快速高通量鑒定外，還用于對較難鑒定菌株的快速識別，如對臨床標(biāo)本分離的544 株（79 個種）厭氧菌鑒定中，332 株（61%）可一次獲得鑒定結(jié)果[24]；對高毒性和耐藥菌株的準(zhǔn)確識別，如應(yīng)用MALDI-TOF-MS分析了85 株經(jīng)spa基因分型方法確定的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，結(jié)果60 株菌得出15 種質(zhì)量圖譜，經(jīng)聚類分析后與分子分型方法相比不僅結(jié)果一致，而且區(qū)分更細[25]。因此，筆者認為在細菌鑒定工作中，如果應(yīng)用MALDI-TOF-MS先行鑒定，再采用分子生物學(xué)技術(shù)如16S rRNA依據(jù)MALDI-TOF-MS給出的排序結(jié)果優(yōu)先分析，將是現(xiàn)階段提高細菌鑒定效率的理想組合。

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Establishment and Application of an Analytical Database for Cronobacter spp. by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry

ZHAO Gui-ming, LIU Yang, CHEN Ying*, YANG Hai-rong, ZHAO Yong-sheng, WANG Ping
(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

The purpose of this study was to establish an analytical database for high throughput identification and subtyping of 8 species of Cronobacter spp. by a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF-MS) method. Under the optimized culture and sample treatment conditions by using the established MALDI-TOFMS protein fingerprint acquisition parameters, the acquired characteristic protein mass spectrometric profiles of 8 reference strains were used to build a MALDI-TOF-MS database with Biotyper software, and the accuracy of the database was validated by comparison with data from related enterobacteriaceae strains and isolates of the genus Cronobacter. The MALDI-TOF-MS database was applied to analyze 135 isolates of Cronobacter spp. with an identification score no smaller than 2.0, which reached the requirement for identification at the species level. Further subtyping was achieved by cluster analysis. This MALDI-TOF-MS database may provide a new approach for high throughput identification and subtyping of Cronobacter strains.

Cronobacter spp.; MALDI-TOF-MS; database; identification; subtyping

TS207.4

A

1002-6630（2014）08-0105-06

10.7506/spkx1002-6630-201408020

2014-03-25

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B02）

趙貴明（1963—），男，研究員，研究方向為食品微生物。E-mail：zhcaiq@163.com

*通信作者：陳穎（1972—)，女，研究員，博士，研究方向為食品安全。E-mail：chenyingcaiq@163.com