何 欣 張海琪 戴志遠(yuǎn)① 王 揚(yáng) 李詩言

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310035;2.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心 杭州 310012)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)屬于龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus),是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,2012年產(chǎn)量為33.1萬t。目前大陸?zhàn)B殖中華鱉的種類主要包括國家水產(chǎn)新品種中華鱉日本品系、清溪烏鱉,本地種中華鱉太湖群體、黃河群體、廣西群體、江西群體,引進(jìn)種臺灣群體、泰國群體以及雜交種,以中華鱉日本品系養(yǎng)殖為最多。中華鱉日本品系的養(yǎng)殖模式主要包括溫室養(yǎng)殖、外塘養(yǎng)殖、兩段法養(yǎng)殖、稻鱉共生、蝦鱉混養(yǎng)等,以兩段法養(yǎng)殖最為普遍,經(jīng) 7—8個(gè)月溫室養(yǎng)殖和 4個(gè)月的外塘養(yǎng)殖,平均規(guī)格在0.75kg以上。隨著中華鱉日本品系的養(yǎng)殖推廣,種質(zhì)管理不嚴(yán),相互引種混雜導(dǎo)致其優(yōu)良性能降低,尤其是在人為控溫、高密度集約化的溫室養(yǎng)殖環(huán)境下,一些養(yǎng)民為追求高產(chǎn)加大了苗種放養(yǎng)密度,受空間制約、管理水平及水質(zhì)惡化等影響,其養(yǎng)殖病害時(shí)有發(fā)生,迫使其使用一些抗生素進(jìn)行病害的有效治療和預(yù)防。已有報(bào)道在中華鱉養(yǎng)殖中使用的漁藥有慶大霉素、氨卞青霉素、新霉素、土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺類藥物、頭孢拉定、諾氟沙星、羅紅霉素等(孫紅祥等,2000;黃鈞等,2008;譚愛萍等,2011;冷闖等,2012;朱凝瑜等,2013)。這些漁藥的使用雖可在短期內(nèi)起到很明顯的療效,但會引起病原的抗藥性,為下一次疾病治療埋下隱患;還會導(dǎo)致其在養(yǎng)殖生物體內(nèi)的積累,進(jìn)而以食物的途徑進(jìn)入人體,影響消費(fèi)安全。雖然大多漁藥的半衰期不長,但由于頻繁使用并進(jìn)入環(huán)境,其引起的環(huán)境污染及其可能導(dǎo)致的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)環(huán)境問題之一。通過漁藥代謝的研究,不僅可以了解漁藥在中華鱉日本品系體內(nèi)的代謝特征,還可以獲得漁藥在中華鱉體內(nèi)的殘留狀況,為其合理應(yīng)用和食用安全提供理論依據(jù)。

漁藥的代謝受品種、溫度、給藥方式等因素的影響,因此不同藥物及同種藥物在不同生物體內(nèi)的殘留代謝不盡相同(湛嘉等,2003)。中華鱉具有獨(dú)特的水陸兩棲生活習(xí)性,有別于魚蝦等水產(chǎn)動物,也有別于其他陸生生物,其藥物殘留代謝有其自身的特點(diǎn),不能用魚蝦等其它水生動物體內(nèi)的藥動學(xué)規(guī)律來套用。目前有關(guān)中華鱉體內(nèi)藥物代謝規(guī)律的研究已有一些報(bào)道,涉及的藥物主要有:氟苯尼考(朱麗敏等,2006;張海琪等,2013b)、諾氟沙星(陳文銀等,1997;周輝明等,2009;朱秋華等,2001)、磺胺甲基異惡唑(尹文林等,2004b)、紅霉素(尹文林等,2004a)等,與其他的水產(chǎn)品種相比研究偏少。頭孢拉定屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素,已有在兔(李忠思等,2005)、羊(黃偉雄等,2000)、鼠(吳桂月等,2001)等動物體內(nèi)的藥動學(xué)研究報(bào)道,而水產(chǎn)動物體內(nèi)尚未見有報(bào)道。諾氟沙星為喹諾酮類漁藥,已有一次口灌、一次注射、連續(xù)注射及一次拌餌口服等不同給藥方式在中華鱉體內(nèi)的代謝研究(陳文銀等,1997;朱秋華等,2001;潘連德等,2005;周輝明等,2009),但未見有連續(xù)多次拌餌給藥方式下中華鱉體內(nèi)的代謝研究報(bào)道。羅紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,是紅霉素經(jīng)過修飾,即9位成肟衍生物的產(chǎn)物(Chantotet al,1986),其在人體中的消除半衰期為12.69h(秦玉花等,2003),在家犬體內(nèi)羅紅霉素消除半衰期為19.50h(唐星等,2003),未見有其在水產(chǎn)動物中的藥代研究報(bào)道。本試驗(yàn)將頭孢拉定、諾氟沙星、羅紅霉素添加到飼料中制作成藥餌口服給藥,并應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分別測定分析中華鱉日本品系在連續(xù) 7d給藥后各組織中頭孢拉定、諾氟沙星、羅紅霉素的殘留變化規(guī)律,為三種藥物的安全合理用藥及休藥期的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

漁藥濃度測定用儀器為API 4000型高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)頭孢拉定純度大于 91.8%,諾氟沙星純度大于 97.8%,羅紅霉素純度大于96.5%。漁藥頭孢拉定(上海新先鋒藥業(yè)有限公司),諾氟沙星(寧波四明制藥有限公司),羅紅霉素(康普藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物采用中華鱉日本品系,來自杭州某生物科技有限公司,取中華鱉日本品系450只,體重為(250±50)g,體質(zhì)健壯,隨機(jī)分為三組,每組 150只,分別放養(yǎng)在大棚控溫水泥池中。試驗(yàn)前馴養(yǎng)7d,經(jīng)抽樣測定頭孢拉定、諾氟沙星或羅紅霉素殘留均未檢出,然后開始給藥實(shí)驗(yàn)。

1.3 給藥方法

分別制作頭孢拉定濃度30mg/kg,諾氟沙星濃度300mg/kg及羅紅霉素濃度 30mg/kg的配合飼料。在(25±2)°C水溫下,分別連續(xù)7d投喂大棚控溫水泥池中養(yǎng)殖的中華鱉日本品系,日投喂藥餌量為體重的1%—2%。每天8:00時(shí)和16:00時(shí)各投喂一次,投放于食臺上,以30min之內(nèi)攝食結(jié)束為止。

1.4 樣品采集與濃度測定

自最后一次投喂之后按 1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h、120h、144h、168h、240h 和 360h進(jìn)行取樣,每次分別從三個(gè)養(yǎng)殖池塘中隨機(jī)各抽取9只,以3只中華鱉的混合組織為一組,3個(gè)平行,取血液于肝素化處理過的離心管中,取肝臟、肌肉組織分別保存于無菌的采樣袋中,20°C冰箱保存待測定。分別參照《GB/T 22960-2008河豚魚和鰻魚中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2008)、《農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定-液相色譜法》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2006)和《SN/T 1777.2-2007動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留測定方法 第2部分:高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2007)進(jìn)行中華鱉組織中頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素殘留濃度測定。采用加標(biāo)回收和精密度評價(jià)檢測方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用藥代動力學(xué) 3p97軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得出藥動學(xué)參數(shù),建立相關(guān)方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法學(xué)評價(jià)

根據(jù)頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素的理化性質(zhì)和分子量,通過一級質(zhì)譜 Q1掃描獲得母離子峰,再進(jìn)行二級質(zhì)譜 Q2掃描,得到碎片離子信息,分別篩選兩個(gè)離子強(qiáng)度較高的離子與母離子組建成MRM離子對,然后優(yōu)化去簇電壓(declustering potential,DP)、碰撞能量(collision energy,CE)、離子噴霧電壓(ion spray voltage,IS)、離子源溫度(ion source temperature,TEM)、碰撞氣(Collision-Activated Dissociation,CAD)、射入電壓(entrance potential,EP)、射出電壓(collision cell exit potential,CXP)等質(zhì)譜參數(shù)。三種藥物優(yōu)化后的部分質(zhì)譜條件如表1所示。色譜柱為 ACQUITY UPLC BEN Shield RP18分析柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流動相為:乙腈–0.1%甲酸水溶液。以空白基質(zhì)樣品分別添加 1、2、4μg/kg 頭孢拉定,100、200、400μg/kg的諾氟沙星和5、10、20μg/kg的羅紅霉素,采用上述建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行方法學(xué)的評價(jià),回收率等結(jié)果如表2所示。由表2可見,與以往大多藥物代謝動力學(xué)研究所采用的液相色譜法相比,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法更具快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢,是一種適宜的藥物代謝動力學(xué)研究手段。

表1 三種藥物優(yōu)化后的部分質(zhì)譜條件Tab.1 MS conditions after optimization of three drugs

表2 三種藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法學(xué)評價(jià)(n=6)Tab.2 The methodological evaluation of the determination of three drugs by HPLC-MS/MS(n=6)

表3 頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素在中華鱉各組織中的濃度(μg/kg)Tab.3 Concentrations of cefradine,norfloxacin and roxithromycin in different tissues from soft-shelled turtles(μg/kg)

2.2 各組織中漁藥殘留濃度變化情況

經(jīng)過對中華鱉日本品系中三種藥物不同時(shí)間點(diǎn)殘留的檢測,頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素在中華鱉各組織中的濃度如表3所示。頭孢拉定在肝臟和肌肉組織中均在2h時(shí)出現(xiàn)最高峰,濃度分別為15.9μg/kg和5.05μg/kg,隨著時(shí)間推移,漁藥濃度逐漸下降,直至96h時(shí)不再測及。在血液中出現(xiàn)了雙峰,分別在2h和8h時(shí),濃度分別為6.00μg/kg和6.93μg/kg。諾氟沙星在血液、肝臟和肌肉組織中均在 4h出現(xiàn)最高峰,濃度分別為 121.8μg/kg、371μg/kg和 35.61μg/kg。隨著時(shí)間推移,濃度逐漸下降。血液和肌肉中分別于168h和 360h時(shí)不再有檢出,而在肝臟中至 360h仍能檢出。羅紅霉素2h在血液中達(dá)到最高濃度19.03μg/kg,隨后逐步下降,至 144h未有檢出。而在肝臟和肌肉中則出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象,最高峰的濃度分別為8.252μg/kg和 13.983μg/kg。

2.3 藥動學(xué)參數(shù)的計(jì)算

通過藥動學(xué) 3P97分析軟件,分別計(jì)算了頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素在中華鱉血液,肝臟和肌肉中的藥動學(xué)參數(shù)。經(jīng)過分析,以Akaike Information Criterion法(AIC信息準(zhǔn)則)作為評判標(biāo)準(zhǔn),頭孢拉定和諾氟沙星在中華鱉血液,肝臟和肌肉中的代謝符合一室消除模型。羅紅霉素在中華鱉血液,肝臟和肌肉中的代謝符合二室消除模型。三種藥物在中華鱉日本品系組織中的藥動學(xué)參數(shù)如表4、表5、表6所示。

表4 頭孢拉定在中華鱉日本品系三種不同組織中的藥動學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of cefradine in three different tissues from soft-shelled turtles Japanese strain

頭孢拉定中C血液= 11.69×e-0.1130t,R2=0.9316;C肝臟=20.16×e-0.0684t,R2=0.9691;C肌肉= 3.599×e-0.0770t,R2=0.9061;諾氟沙星中C血液= 129.21×e-0.0308t,R2=0.9267;C肝臟= 409.6×e-0.0167t,R2=0.9996;C肌肉= 31.24×e-0.0179t,R2=0.9486;羅紅霉素中C血液= 40.21×e-0.8514t+1.471×e-0.1798t,R2=0.9884;C肌肉= 3.349×e-0.0816t+5.358×e-0.04430t,R2=0.9342;C肝臟= 4.942×e-0.07221t+0.7362×e-0.006898t,R2=0.9396。頭孢拉定在中華鱉日本品系血液、肌肉和肝臟中消除半衰期T1/2(Ke)分別為6.132h、9.002h和 10.132h。諾氟沙星在中華鱉日本品系血液、肌肉和肝臟中消除半衰期T1/2(Ke)分別為22.526h、39.715h和 41.585h。羅紅霉素在中華鱉日本品系血液、肌肉和肝臟中消除半衰期T1/2(β)分別為38.54h、15.65h和100.5h。

表5 諾氟沙星在中華鱉日本品系三種不同組織中的藥動學(xué)參數(shù)Tab.5 Pharmacokinetic parameters of norfloxacin in three different tissues from soft-shelled turtles Japanese strain

表6 羅紅霉素在中華鱉日本品系三種不同組織中的藥動學(xué)參數(shù)Tab.6 Pharmacokinetic parameters of roxithromycin in three different tissues from soft-shelled turtles Japanese strain

3 討論

3.1 藥時(shí)曲線中多峰現(xiàn)象的討論

本次實(shí)驗(yàn)中華鱉經(jīng)過連續(xù)7d投喂三種藥物之后,其中頭孢拉定和羅紅霉素的藥-時(shí)曲線中出現(xiàn)了雙峰的現(xiàn)象。該現(xiàn)象也存在于不少藥動學(xué)研究中,如給家兔灌胃阿司匹林腸溶片后,受試動物的藥時(shí)曲線均有雙峰現(xiàn)象(談恒山等,1994)。目前有關(guān)多峰的產(chǎn)生大致有兩種可能的機(jī)制:一是由于藥物在胃腸道中存在的不同部位有多個(gè)吸收位點(diǎn),口服后在不同部位的吸收時(shí)間和吸收速率產(chǎn)生了不一致,被吸收的藥物在血液中疊加形成雙峰或多峰現(xiàn)象;二是藥物的肝腸循環(huán)作用,即藥物在腸道被重吸收所導(dǎo)致(Manishet al,2003;魏鳳環(huán)等,2005)。

3.2 三種藥物在中華鱉日本品系體內(nèi)不同組織的消除半衰期規(guī)律的探討

本試驗(yàn)選用頭孢拉定、諾氟沙星和羅紅霉素進(jìn)行連續(xù)給藥 7d拌餌投喂的方式給藥,從三種藥物在中華鱉日本品系體內(nèi)的半衰期來看,頭孢拉定在中華鱉日本品系血液、肝臟和肌肉中消除半衰期分別為6.132h、10.132h和9.002h,時(shí)間最短。諾氟沙星在血液、肝臟和肌肉中的消除半衰期分別是 22.526h、41.585h和39.715h。羅紅霉素在血液、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為38.54h、15.65h和100.5h,時(shí)間最長。羅紅霉素的蛋白結(jié)合率高達(dá)90%—95%,有較強(qiáng)的滲透能力,呼吸道及血液內(nèi)的濃度高,能夠穿透并能進(jìn)入吞噬細(xì)胞內(nèi)(單靖珊,1999),主要由膽汁與糞便排除體外,尿排出量很少(陳強(qiáng),1994)。諾氟沙星的口服后約35%—45%的給藥量可被吸收,蛋白結(jié)合率為14%(李海濱等,1997),排泄主要通過腎臟,其次通過肝臟消除(曾振靈等,1992)。而頭孢拉定除了在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化外,原藥幾乎全部從腎臟中排除(張志林等,1989)。因此體內(nèi)的蛋白結(jié)合率與原藥排泄的途徑是影響藥物在動物體內(nèi)消除半衰期的重要因素之一。

與其他研究相比,頭孢拉定在中華鱉血液中的半衰期遠(yuǎn)長于人血液中的1.13h(石焱等,2009)、老鼠血液中的 145.65min(梁駿,2008)和雞血液中的65.493min(杜云良等,2010)。有學(xué)者認(rèn)為導(dǎo)致種屬間差異的原因包括某種酶的有無或活性的差別,以及血漿蛋白結(jié)合率,靶器官結(jié)合率等(鄒文等,2007)。此外,溫度的不同也是重要因素,本實(shí)驗(yàn)中采用的水溫是(25±2)°C,中華鱉體內(nèi)溫度遠(yuǎn)低于雞的 41.5—43.0°C、人和老鼠的35—38.5°C的正常體溫,因此半衰期相對要長一些。本實(shí)驗(yàn)在(25±2)°C的水溫下,諾氟沙星采用連續(xù)給藥 7d的給藥方式,在中華鱉日本品系血液中至144h時(shí)不再有檢出,肌肉在240h仍能檢出,而肝臟則在 360h時(shí)仍然能檢出殘留,結(jié)果與以往研究結(jié)果相似,如潘連德等(2005)研究表明,經(jīng)單次口服灌胃給藥,患病和健康的中華鱉血液中的諾氟沙星適合于一室消除模型,其消除半衰期分別為 17.279h和 45.112h;朱秋華等(2001)在 30°C的水溫中以3種水平混入飼料中投喂中華鱉,其血液中的諾氟沙星在120h時(shí)仍能檢出殘留,直到240h才未檢出。肌肉組織中可達(dá)到相對較高水平,在停藥后肌肉中藥物殘留量較高,直到240h排出75.8%。在生產(chǎn)實(shí)踐中,諾氟沙星大多采用多次拌餌的給藥方式進(jìn)行,因此本結(jié)果更具應(yīng)用性。本實(shí)驗(yàn)中羅紅霉素(25±2)°C下在中華鱉日本品系血液、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為38.54h,比人體血液的12.69h和家犬體內(nèi)的 19.50h要高,也比紅霉素在中華鱉中的消除半衰期要長(尹文林等,2004a),因此羅紅霉素作為漁藥使用,需要更長的休藥期。

3.3 漁藥殘留監(jiān)控組織的選擇

不同的漁藥在水產(chǎn)動物體內(nèi)各組織中的殘留持久性不盡相同,因此對水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控提出不同的要求。目前,我國允許諾氟沙星作為漁藥使用,其在水產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)(MRL)為50μg/kg(《NY5070-2001無公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》)。2005年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第 560號公告將羅紅霉素和頭孢拉定列為抗生素、合成抗菌藥及農(nóng)藥類范疇(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2006),至今未有相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。羅紅霉素和紅霉素都屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,紅霉素屬于無公害標(biāo)準(zhǔn)的禁用漁藥,由于羅紅霉素的結(jié)構(gòu)和治療功效與其相似,因此羅紅霉素是替代紅霉素的首選漁藥。通過羅紅霉素于紅霉素在中華鱉組織中的代謝情況的分析,羅紅霉素比紅霉素的消除半衰期更長,需要更長的休藥期方能上市。在以往的水產(chǎn)品質(zhì)量安全殘留監(jiān)控中,全部采用肌肉組織作為監(jiān)控組織。但從本文的三種藥物以及本實(shí)驗(yàn)室以往報(bào)道的氟甲喹的結(jié)果來看(張海琪等,2013a),肝臟組織的濃度要遠(yuǎn)高于肌肉組織。肝臟器官作為代謝場所,除了通過腎臟以原型藥物排出體外之外,漁藥在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化必須要通過的細(xì)胞色素P450酶系在肝臟中的含量最豐富(Slaughteret al,1995),因此肝臟組織濃度普遍高于其它組織。在人們對水產(chǎn)品質(zhì)量安全要求越來越高的背景下,建議在殘留監(jiān)控時(shí),選擇肝臟組織進(jìn)行分析。

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