章盈盈 袁澤軼 王 清 李巧梅 吳惠豐 趙建民①

(1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過(guò)程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264003;2.國(guó)家海洋信息中心 天津 300171;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)是一類廣泛分布的多功能超家族酶系,主要催化還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基與疏水性化合物的親電子基團(tuán)結(jié)合,將其轉(zhuǎn)化為水溶性代謝產(chǎn)物并排出體外,從而達(dá)到解毒目的(Eatonet al,1999)。此外,GST具有過(guò)氧化物酶和異構(gòu)酶活性,可參與氧化應(yīng)激信號(hào)通路的調(diào)節(jié),避免 H2O2等引起的細(xì)胞死亡(Adleret al,1999;Hayeset al,2005);同時(shí),GST能夠以非催化的形式結(jié)合多種內(nèi)源或外源配體,參與氧化損傷生物大分子的修復(fù)及被氧化含巰基蛋白的再生(Sheehanet al,2001;Laborde,2010)。GST 已被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的所有生物中(Pearson,2005)。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)定位,GST可分為胞質(zhì)型(Cytosolic GST)、線粒體型(Mitochondria GST,也稱為Kappa GST)和微粒體型(Microsomal GST)GST三大類。其中,胞質(zhì)型 GST分布最廣,根據(jù) N-端氨基酸序列、底物特異性等特征,可分成 Alpha、Beta、Rho、Omega等13類;微粒體型GST是一類膜結(jié)合蛋白,活化后能夠防止脂質(zhì)的過(guò)氧化作用(Mosialouet al,1993),且多具有過(guò)氧化物酶活性(Prabhuet al,2001),現(xiàn)已被歸入?yún)⑴c花生四烯酸與谷胱甘肽代謝(MAPEG)的膜結(jié)合蛋白家族(Jakobssonet al,1999;Hayes et al,2005)。

菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)是我國(guó)沿海各地廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)貝類,其病害問(wèn)題是制約蛤仔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸之一。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)作為海洋環(huán)境中的常見(jiàn)致病菌之一,已被證明是導(dǎo)致多種雙殼貝類發(fā)病及死亡的重要原因。通過(guò)探討菲律賓蛤仔抗病功能基因在病原菌感染下的表達(dá)規(guī)律,有助于深入了解機(jī)體的固有免疫防御系統(tǒng)。本研究采用 cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技術(shù),從菲律賓蛤仔中克隆獲得 Rho型 GST(VpGSTR)和微粒體型GST(VpGSTMi)的cDNA全長(zhǎng)序列,并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了VpGSTR和VpGSTMi的組織分布及其在鰻弧菌刺激下的時(shí)序表達(dá)特征,可為進(jìn)一步探討 GST在菲律賓蛤仔抵御病原侵染中的免疫功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及試劑

實(shí)驗(yàn)用菲律賓蛤仔(殼長(zhǎng) 3—4cm)購(gòu)于煙臺(tái)當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng),在過(guò)濾海水中暫養(yǎng)10d后開(kāi)始鰻弧菌侵染實(shí)驗(yàn);暫養(yǎng)期間,持續(xù)曝氣,每天定時(shí)投喂扁藻并進(jìn)行完全換水。

Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于美國(guó)Promega公司,Taq DNA Polymerase購(gòu)于美國(guó) Fermentas公司,pMD18-T載體、DNA Marker、SYBR Premix Ex TaqTM均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品,凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 組織取樣及鰻弧菌刺激

實(shí)驗(yàn)用的鰻弧菌購(gòu)于中國(guó)海洋微生物保藏中心,株型為1A07299。將鰻弧菌接種于2216E液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后離心收集菌體;采用滅菌過(guò)濾海水重懸菌體,以 107CFU/mL的濃度浸泡刺激菲律賓蛤仔;分別在處理后 6、12、24、48、96h采集血淋巴樣品,低速離心(2000r/min,4°C)收集血淋巴細(xì)胞用于總RNA提取,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集6個(gè)平行樣本。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,設(shè)置未經(jīng)任何處理的對(duì)照組。

分別采集對(duì)照組的肝胰腺、血淋巴細(xì)胞、鰓、性腺和肌肉組織,用以測(cè)定目的基因的組織表達(dá),每個(gè)組織設(shè)置6個(gè)平行。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取使用 Trizol試劑,具體操作參照說(shuō)明書。cDNA合成按照美國(guó)Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶操作說(shuō)明書進(jìn)行;以總 RNA為模板,Oligo dT為逆轉(zhuǎn)錄引物,反應(yīng)條件如下:70°C 5min,冰上放置 1—2min,42°C 50min,65°C 15min 終止反應(yīng),并于4°C結(jié)束程序。

1.4 目的基因全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的 EST序列,分別設(shè)計(jì)基因特異 性 引 物 :VpGSTR(F1:5′-TTACCGCTGGATGAA CAAGG-3′,F2:5′-AAGAACGCCAACACTGGATA-3′),VpGSTMi(F3:5′-CGTATTGCCCTTCGTTCTGA-3′,F4:5′-ACATGCCAGCCCTAATCACA-3′)。采用巢氏PCR擴(kuò)增后,將純化的目的片段連接到pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化至Escherichia coliTop10F′感受態(tài)細(xì)胞;經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定,分別挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆送至北京諾賽基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 生物信息學(xué)分析

將獲得的 VpGSTR和 VpGSTMi序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè),并采用 BLAST在線程序進(jìn)行比對(duì)分析。經(jīng) CLUSTALⅩ進(jìn)行多序列比對(duì)排列后,用 MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),計(jì)算方法為鄰位相連法(Neighbor-Joining)和自展內(nèi)部分枝法(Bootstrapping)評(píng)定進(jìn)化樹(shù)的可靠性,重復(fù)次數(shù)為1000。

1.6 VpGSTR和VpGSTMi基因的時(shí)空表達(dá)

采用ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng),測(cè)定目的基因的組織分布及其在鰻弧菌刺激后的時(shí)序表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,以菲律賓蛤仔β-actin為內(nèi)參基因(Actin-RT-F:5′-CTCCCTTGAGA AGAGCTACGA-3′,Actin-RT-R:5′-GATACCAGCAGATTCCATACCC-3′);VpGSTR和 VpGSTMi的基因特異性引物分別為:VpGSTR-F:5′-AAGACGGGGATCTTGTTGTG-3′,VpGSTR-R:5′-TCTCTGTCACGTTCGTTTGC-3′;VpGSTMi-F:5′-ACGTATTGCCCTTCG TTCTG-3′,VpGSTMi-R:5′-AACATGCCAGCCCTAATCAC-3′。熒光定量 PCR參照本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)優(yōu)化的擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件進(jìn)行(Zhanget al,2012),數(shù)據(jù)處理采用 2?ΔΔCT法(Livaket al,2001),使用 SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),P＜0.05認(rèn)定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

通過(guò)序列拼接,分別獲得VpGSTR與VpGSTMi的全長(zhǎng) cDNA序列,GenBank注冊(cè)號(hào)依次為GQ384394與GQ384399。其中,VpGSTR的開(kāi)放閱讀框(ORF)包括 705bp(圖1),編碼 234個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為 27.43kDa,理論等電點(diǎn)為 9.64。經(jīng) BLAST比對(duì)分析可知,VpGSTR基因編碼的蛋白序列與南極帽貝(Laternula elliptica)GSTR的相似性為64%,而與其它物種的序列相似性較低。SMART軟件分析顯示,VpGSTR為分泌型蛋白,具有典型的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 N-末端結(jié)構(gòu)域(G位點(diǎn),M1—E76)和 C-末端結(jié)構(gòu)域(H位點(diǎn),T108—R198)。多重比對(duì)結(jié)果表明,參與谷胱甘肽結(jié)合的 N-末端區(qū)域較為保守,而與特異性疏水底物結(jié)合的C-末端保守性較低(圖2)。

VpGSTMi的ORF包括450bp(圖3),編碼149個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為 16.74kDa,理論等電點(diǎn)為9.84。BLAST分析發(fā)現(xiàn),VpGSTMi編碼的蛋白序列與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)及皺紋盤鮑(Haliotis discus discus)的相似性分別是和61%和62%。Pfam在線軟件分析顯示,VpGSTMi具有典型的 MAPEG(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism)膜蛋白結(jié)構(gòu)域(F16—R145)。此外,微粒體型 GST的酶活性位點(diǎn)精氨酸殘基(R114)和酪氨酸殘基(Y121)也高度保守(圖4)。

圖1 VpGSTR全長(zhǎng)cDNA序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA of VpGSTR and deduced amino acid sequence

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,胞質(zhì)型 GST和微粒體型 GST分別聚類(圖5)。本研究獲得的 VpGSTR和VpGSTMi分別歸于Rho型簇和微粒體型簇。VpGSTR首先與菲律賓蛤仔的Rho亞型、南極帽貝(L.elliptica)聚成一簇,這三個(gè)物種的 GSTR再與斑馬魚(yú)(Danio rerio)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)等魚(yú)類的GSTR聚成Rho型GST分支;而VpGSTMi歸屬于MAPEG家族中的GSTMi1,并與GSTMi3、GSTMi2形成微粒體型GST分支。VpGSTMi與長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)、皺紋盤鮑(H discus discus)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)聚成一個(gè)分支,表明 VpGSTMi與無(wú)脊椎動(dòng)物的GSTMi親緣關(guān)系較近,而與哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由上可見(jiàn),菲律賓蛤仔 Rho型和微粒體型 GST在進(jìn)化分類中的地位與傳統(tǒng)分類學(xué)中的位置相符合。

2.3 VpGSTR和VpGSTMi基因的組織分布

利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù),檢測(cè)了 VpGSTR和VpGSTMi基因在菲律賓蛤仔的組織分布特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在肝胰腺、鰓、血淋巴細(xì)胞、外套膜和肌肉中均可檢測(cè)到VpGSTR和VpGSTMi基因的表達(dá),且均以肝胰腺組織中的表達(dá)水平最高。其中,VpGSTR的表達(dá)從高到低依次為肝胰腺＞鰓＞血淋巴細(xì)胞＞外套膜＞肌肉(圖6a),而VpGSTMi的表達(dá)水平則為肝胰腺＞血淋巴細(xì)胞＞鰓＞外套膜＞肌肉(圖6b)。

圖2 VpGSTR與其它物種GSTR的多重比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of VpGSTR with GSTR from Laternula elliptica (ACM44933),Daniorerio (NP001038525),Cyprinus carpio (ABD67511),Oreochromis aureus (ACT22667)

圖3 VpGSTMi全長(zhǎng)cDNA序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.3 The full-length cDNA of VpGSTMi and deduced amino acid sequence

圖4 VpGSTMi與其它物種GSTMi的多重比對(duì)結(jié)果Fig.4 Multiple alignment of deduced amino acid sequence of VpGSTMi with GSTMi from Bubalus bubalis (AEB71425),Xenopus laevis(NP001084720),Homo sapiens (AAP36387),Haliotis discus discus (ABO26660),and Ictalurus furcatus (ADO28130)

圖5 Rho型GST和微粒體型GST的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree of Rho and microsomal class GST proteins constructed by neighbor-joining method based on the sequences from different animals

2.4 VpGSTR和VpGSTMi在鰻弧菌刺激后的時(shí)序表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR,分析了鰻弧菌刺激后菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞中VpGSTR和VpGSTMi基因的時(shí)序表達(dá)(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鰻弧菌刺激 6h后,VpGSTR基因表達(dá)量較對(duì)照組水平無(wú)顯著變化;在菌刺激12h和24h后,VpGSTR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05),分別達(dá)到對(duì)照組的2.5倍和3.5倍;隨著菌刺激時(shí)間的延長(zhǎng),VpGSTR基因的表達(dá)量逐步回落,在 96h降低到對(duì)照組水平。與 VpGSTR類似,VpGSTMi基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)逐步上升而后又降至對(duì)照水平的趨勢(shì);其中,暴露 24h后 VpGSTMi基因的表達(dá)量較對(duì)照組水平顯著升高(2.7倍,P＜0.05)。

圖6 VpGSTR(a)和VpGSTMi(b)在菲律賓蛤仔中的組織分布特征Fig.6 Tissue distribution of VpGSTR(a)and VpGSTMi(b)determined by qRT-PCR

圖7 菲律賓蛤仔經(jīng)鰻弧菌刺激后VpGSTR(a)和VpGSTMi(b)基因的時(shí)序表達(dá)Fig.7 The temporal expression of VpGSTR(a)and VpGSTMi(b)mRNA in the clams post Vibrio anguillarum challenge

3 討論

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶普遍存在于生物體內(nèi),在機(jī)體有毒化合物代謝轉(zhuǎn)化和抗氧化反應(yīng)等過(guò)程中起著重要作用。目前,已在多種海洋動(dòng)物中先后發(fā)現(xiàn)了多種類型的GST的存在(Wanet al,2008;Xuet al,2010;Liet al,2012;Saranyaet al,2012;Umasuthanet al,2012;Zhanget al,2012;Espinozaet al,2013)。本研究克隆獲得了菲律賓蛤仔兩種 GST的 cDNA序列,分別屬于 Rho型和微粒體型家族。序列分析表明,VpGSTR具有典型的谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 N-末端結(jié)構(gòu)域(G位點(diǎn))和C-末端結(jié)構(gòu)域(H位點(diǎn))。其中,N-末端主要為谷胱甘肽提供結(jié)合位點(diǎn),具有高度保守的色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、結(jié)氨酸和谷氨酰胺殘基(Parket al,2009);而C-末端為特異性的疏水底物提供結(jié)合位點(diǎn),其氨基酸變異程度較高,利于不同底物的結(jié)合(Mannerviket al,1988;Blanchetteet al,2007)。VpGSTMi氨基酸序列存在保守的精氨酸殘基(R114)和酪氨酸殘基(Y121);其中,精氨酸殘基(R114)被認(rèn)為是MAPEG家族催化功能的作用位點(diǎn),而酪氨酸殘基(Y121)可能與酶的活性相關(guān)。同時(shí),兩個(gè)氨基酸殘基位置上的相近,有利于催化形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(Jakobssonet al,1999;Chenet al,2011)。

由于 GST功能的多樣性,其在不同物種中的組織分布存在較大差異;且多種內(nèi)源或者外源因素都被證明可介導(dǎo) GST在組織中表達(dá)量的變化。本研究發(fā)現(xiàn),VpGSTR和VpGSTMi廣泛存在于所檢測(cè)組織中,并以肝胰腺組織中的表達(dá)水平最高。這與已有的研究結(jié)果相一致,即GST呈多組織分布,且多數(shù)GST在海洋動(dòng)物的肝胰腺或肝臟組織中呈高表達(dá)水平(Kimet al,2009;Parket al,2009;鄒青青等,2010;Chenet al,2011)。肝胰腺被認(rèn)為是外源毒物和細(xì)菌積聚的主要位點(diǎn),GST作為重要的解毒酶和抗氧化酶,可能參與了病原菌侵染過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量活性氧的清除(Pushpamaliet al,2008)。此外,VpGSTMi在血淋巴細(xì)胞中也有較高水平的表達(dá),推測(cè)其在血細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御中發(fā)揮了重要作用。類似的現(xiàn)象在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中也有發(fā)現(xiàn),Delta型GST被認(rèn)為與血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)(Zhaoet al,2010)。

本研究中,通過(guò)測(cè)定鰻弧菌侵染后血淋巴細(xì)胞GST基因表達(dá)量的變化,探討了 VpGSTR和VpGSTMi在菲律賓蛤仔免疫防御反應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示,鰻弧菌刺激可誘導(dǎo)VpGSTR和VpGSTMi基因的表達(dá),并在刺激后 24h達(dá)到基因表達(dá)的最高峰,隨后逐漸恢復(fù)至初始水平。目前,有關(guān)海洋動(dòng)物受弧菌侵染后 GST基因表達(dá)量變化的結(jié)果已有報(bào)道。例如,馬氏珠母貝(Pinctada martensii)血細(xì)胞微粒體型GST和長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)Sigma型GST在弧菌刺激6h后的表達(dá)水平顯著提高(Labreucheet al,2006;Chenet al,2011)。海洋雙殼貝類由于其濾食習(xí)性,會(huì)從周圍水環(huán)境中積累大量的細(xì)菌。在應(yīng)對(duì)弧菌等細(xì)菌的侵染時(shí),貝類通過(guò)改變活性氧(ROS)產(chǎn)生、血細(xì)胞吞噬、水解酶活性等來(lái)達(dá)到免疫目的(Canesiet al,2002)。ROS的增加有利于殺滅入侵細(xì)菌,但過(guò)量的活性氧對(duì)貝類自身也具有毒害作用,因此必須予以清除?？寡趸赶到y(tǒng)對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi) ROS的水平、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化損傷具有重要作用。研究表明,細(xì)菌侵染時(shí)伴隨吞噬引起的呼吸暴發(fā)產(chǎn)生的ROS、有毒的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物、有機(jī)過(guò)氧化物和細(xì)菌內(nèi)毒素等均能使得 GST表達(dá)量發(fā)生變化(Dubovskiyet al,2008)。因此,在細(xì)菌刺激過(guò)程中,GST可能協(xié)同過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、硫氧還蛋白(TRx)等多種酶類參與了活性氧的清除。

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