王紅霞 陸斗定 何飄霞 戴鑫烽 夏 平 李冬融

(國家海洋局第二海洋研究所 國家海洋局海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點實驗室 杭州 310012)

多環(huán)旋溝藻(Cochlodinium polykrikoidesMargalef)為一種廣布有毒藻,隸屬于甲藻門(Dinophyta),甲藻綱(Dinophyceae),裸甲藻目(Gymnodiniales),裸甲藻科(Gymnodiniaceae),旋溝藻屬(Cochlodinium)(陸斗定,2008)。該藻裸露,以單細(xì)胞、2個和4個細(xì)胞成串存在,偶爾有 8個和 16個細(xì)胞成串(Tomaset al,2008)。多環(huán)旋溝藻的同種異名有Cochlodinium heterolobatumSilva(Silva,1967),Cochlodiniumsp.Schütt(Kumadaet al,1980)和Cochlodinium catenatumOkamura(Hargraveset al,1981)。Iwataki等依據(jù)核糖體大亞基基因序列(LSU rDNA)所做的系統(tǒng)進(jìn)化分析將多環(huán)旋溝藻分成了4支不同的地域亞型,包括東亞型(East Asian)、美國/馬來西亞型(American/Malaysian)、菲律賓型(Philippines)和地中海型(Mediterranean)(Iwatakiet al,2008;Reneet al,2013)。目前,旋溝藻屬已大約有 40種被描述,雖然其中一些在形態(tài)上相差甚大,但是都具有該屬的特征,即橫溝環(huán)繞細(xì)胞多于1.5 圈(Iwatakiet al,2007)。

Margalef(1961)于1961年首次對多環(huán)旋溝藻進(jìn)行了描述。近年來,多環(huán)旋溝藻在全球的各個海域陸續(xù)被報道,此藻形成的有害赤潮事件通常伴有魚類的大量死亡,已在大西洋西岸、西太平洋、東太平洋和印度洋發(fā)生(Gárate-Lizárragaet al,2000;Morales-Blakeet al, 2001;Matsuokaet al,2004,2009;Vargas-Monteroet al,2004;Antonet al,2008;Azanzaet al,2008;Gobleret al,2008;Tanget al,2009a,b)。另外,該藻在亞太地區(qū)的地理分布格局已明顯增加,包括日本、韓國、菲律賓、沙巴和馬來西亞的熱帶到亞熱帶海域(Reloxet al,2003;Azanzaet al,2005;Antonet al,2008)。1995年,在韓國由多環(huán)旋溝藻引發(fā)的赤潮導(dǎo)致的魚類死亡造成了九千五百多萬美元的經(jīng)濟損失(Kim,1997)。而 2008—2009年,發(fā)生在阿拉伯灣和阿曼灣的多環(huán)旋溝藻赤潮持續(xù)時間多達(dá)八個月之久,殺死了數(shù)千噸的養(yǎng)殖魚(Richlenet al,2010)。

東海由于其特殊的地理條件和獨特的富營養(yǎng)環(huán)境,已成為我國赤潮發(fā)生最嚴(yán)重的區(qū)域之一(張傳松等,2008)。該海域赤潮暴發(fā)在時間和規(guī)模上均有所加劇,并且有毒有害藻在不斷增加(蘇紀(jì)蘭,2001;周名江等,2001),比如新近報道的劇毒卡爾藻(Karlodinium veneficumJ.Larsen)(王紅霞等,2011)。多環(huán)旋溝藻已在全球范圍內(nèi)擴張,加之其對魚類的有毒特性,受到各國研究者的廣泛關(guān)注。黃長江(2000)曾報道在1998年我國珠江口海域發(fā)生的大規(guī)模赤潮中發(fā)現(xiàn)了多環(huán)旋溝藻,但在其所拍該藻的光學(xué)照片中并未見其分類特征,而且與其相似的雙胞旋溝藻(Cochlodinium geminatumSchütt)最近被報道在珠海發(fā)生赤潮(歐林堅等,2010;Shenet al,2012),因此并不能確定該藻為多環(huán)旋溝藻。本研究中將形態(tài)方法和分子方法相結(jié)合,對分離自我國東海的多環(huán)旋溝藻藻株進(jìn)行了詳細(xì)的分類學(xué)描述和分子系統(tǒng)發(fā)育分析,填補了我國在該藻分類學(xué)上的空白,為多環(huán)旋溝藻在我國海域及東亞地區(qū)的地理分布情況提供科學(xué)依據(jù),進(jìn)而為提高赤潮藻監(jiān)測和預(yù)警質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種的分離純化和培養(yǎng)

實驗所用藻種分離于2011年7月在東海溫嶺海域所采的赤潮水樣。藻株分離采用逐級稀釋法并結(jié)合毛細(xì)管分離法,獲得單細(xì)胞藻株(實驗室編號為LAMB110745)。藻種分離培養(yǎng)的條件是溫度25°C,鹽度為30—31,光暗循環(huán)為L︰D=12︰12,光照強度為100mol/(m2·s)。

1.2 樣品處理與形態(tài)觀察

1.2.1 光學(xué)和熒光顯微鏡 利用光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CX31)觀察多環(huán)旋溝藻的活體藻細(xì)胞達(dá)到一定的密度后,取少許處于生長指數(shù)期的藻液,用魯哥染液固定,然后選取 50個藻細(xì)胞進(jìn)行測量。在熒光顯微鏡(LEICA DM5000B)下觀察多環(huán)旋溝藻細(xì)胞的葉綠體形態(tài)及分布。

1.2.2 掃描電鏡 吸取指數(shù)期的藻液5mL于離心管中,離心5min(1343×g),收集大約0.5mL濃縮的藻液,然后用鋨酸固定1.5h,并用去離子水進(jìn)行洗脫。隨后用一系列濃度梯度(10%、30%、50%、70%、80%、90%和95%)的酒精各脫水15min(De Salaset al,2008),接著用 100%的酒精和 100%的丙酮各脫水兩次。處理完后進(jìn)行臨界點干燥和噴金,最后在掃描電鏡(HITA CHIS-3000N)下觀察結(jié)果。

1.3 分子測序與系統(tǒng)進(jìn)化分析

1.3.1 分子測序 取指數(shù)期藻培養(yǎng)液 50mL,離心10min(1343×g),收集藻細(xì)胞沉淀并將其轉(zhuǎn)移至 EP(eppendorf tube)管中。然后利用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA。提取的DNA序列作為PCR的模板來擴增大約900bp的LSU rDNA序列,擴增引物為D1RF和D3Car(Mikulskiet al,2005)。PCR的反應(yīng)體系為 50μL,包括正向引物 D1RF和反向引物D3Car各1μL,10X緩沖液5μL,dNTP混合液4μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,基因組DNA提取液2μL,最后加無菌雙蒸水至 50μL。PCR的基本程序為:預(yù)變性:95°C,5min;94°C,1min;55°C,1min;72°C,2min;30個循環(huán);延伸:72°C,5min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,然后用濃度為 0.5%的 EB(溴化乙錠)染色,最后在凝膠成像分析儀下進(jìn)行凝膠成像與圖譜分析。條帶清晰的序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 所測得的核糖體大亞基D1—D3區(qū)序列先在NCBI中與其他藻株的序列進(jìn)行比對。然后采用 ClustalW 軟件包進(jìn)行多序列匹配排列。其次利用Mega4.1軟件包,根據(jù)“Kimura雙參數(shù)”法則,采用 Neighbor-joining(NJ)方法,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支的重復(fù)數(shù)均為1000。Jukes-Cantor距離矩陣的構(gòu)建,則是用 Mega4.1軟件包,采用 NJ法,Jukes-Cantor方式計算而獲得。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)特征

2.1.1 光學(xué)和熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征 多環(huán)旋溝藻東海藻株(LAMB110745)單細(xì)胞的大小為長25—36μm,寬16—22μm。在光學(xué)顯微鏡下可看到細(xì)胞呈鏈狀形態(tài),橫溝較深且環(huán)繞細(xì)胞,縱溝較細(xì)隨著橫溝延伸(圖1a)。細(xì)胞核較大,位于上錐,葉綠體呈條狀或短棒狀分布于整個細(xì)胞中(圖1b)。在熒光顯微鏡下可清晰看到多環(huán)旋溝藻的葉綠體為棒狀,數(shù)量較多并呈簇狀分布(圖1c)。

2.1.2 掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)特征 在掃描電鏡下多環(huán)旋溝藻的單細(xì)胞上錐的頂端為圓錐形,下錐為半球形。從細(xì)胞腹面觀可見橫溝寬且深,左旋繞細(xì)胞兩圈,而且鞭毛鑲嵌在橫溝中。縱溝細(xì)且淺,在上錐與橫溝平行環(huán)繞細(xì)胞,在下錐則發(fā)生錯位延伸至細(xì)胞底部淺裂端(圖2a)。而從細(xì)胞背面觀可見橫溝在上下錐各繞細(xì)胞一圈,在上錐縱溝在橫溝下面緊挨著橫溝延伸(圖2d)。在細(xì)胞的頂部有兩條細(xì)且長的頂溝,并行排列(圖2b)。從細(xì)胞的背頂面可清楚看到兩條頂溝在最后端由一條短且細(xì)的溝相連,呈U形(圖2e)。成串的前面細(xì)胞上錐較尖,下錐圓且扁,后面細(xì)胞的上錐鈍圓且末端淺裂。細(xì)胞在經(jīng)向稍被壓縮,橫溝縱溝清晰可見,在細(xì)胞的底部伸出一根細(xì)且長的鞭毛(圖2c)。

圖1 光學(xué)和熒光顯微鏡下多環(huán)旋溝藻(LAMB110745)的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Light micrographs and laser scanning images of Cochlodinium polykrikoides (LAMB110745)

圖2 掃描電鏡下多環(huán)旋溝藻(LAMB110745)的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Scanning electron images of C.polykrikoides(LAMB110745)

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

通過正序引物“D1RF”和倒序引物“D3car”對東海藻株多環(huán)旋溝藻(LAMB110745)的核糖體大亞基D1—D3區(qū)進(jìn)行擴序,獲得870bp的分子序列。將所獲得的D1—D3區(qū)序列與GenBank中其他已報道的多環(huán)旋溝藻 D1—D3區(qū)序列進(jìn)行比對可知,藻株LAMB110745與香港藻株(EF506623)相似度為100%,無堿基差異。

以Azadinium poporum(KC286552)為種外群,用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹上可知,東海藻株(LAMB110745)與GenBank中的韓國藻株(EF506618、AY725423、EF506620、EF506622、AY347309)、日本藻株(AB295045、AB288383)以及香港藻株(EF506623)聚在一起,且支持率為 100%,表明它們同屬于東亞型。另外,屬于美國/馬來西亞型的 6株多環(huán)旋溝藻,屬于地中海型的6株和屬于菲律賓型的2株藻株均以高支持率聚在一起,表明多環(huán)旋溝藻藻株具有明顯的地域差異。

利用 Mega4.1軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析中各藻株間的遺傳距離矩陣(表1)。多環(huán)旋溝藻東海藻株(LAMB110745)與同屬于東亞型的香港、韓國和日本藻株親緣關(guān)系近,遺傳距離均為 0.000。而與美國/馬來西亞型和菲律賓型的多環(huán)旋溝藻藻株的親緣關(guān)系次之,這與系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合。測序的東海藻株多環(huán)旋溝藻與種外群Azadinium poporum親緣關(guān)系最遠(yuǎn),遺傳距離為0.121。

圖3 基于核糖體大亞基D1—D3區(qū)所構(gòu)建的多環(huán)旋溝藻的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees of the C. polykrikoides based on the D1—D3 rDNA sequences

3 討論

有研究指出,多環(huán)旋溝藻的細(xì)胞形態(tài)和形成的赤潮周期存在密切關(guān)系(Tomaset al,2008)。此外,有效證據(jù)表明旋溝藻屬可產(chǎn)生暫時性和休眠性孢子,這可能與它們的生活史相關(guān),并導(dǎo)致該屬在全球擴張(Kudelaet al,2012)。

在對多環(huán)旋溝藻的鑒定和識別中,形態(tài)特征很重要,包括細(xì)胞大小和形狀,棒狀葉綠體和橫溝的旋轉(zhuǎn)度,橫溝繞細(xì)胞 1.8—1.9圈(Faustet al,2002;Matsuokaet al,2008)。從馬來西亞分離得到的多環(huán)旋溝藻標(biāo)本長 50μm,而從日本、韓國和美國東北部分離的藻株較小些,為 30—40μm(Matsuokaet al.,2008)。此外,Anton等(2008)報道的分離于馬來西亞沙巴州的多環(huán)旋溝藻藻株長為28—40μm,寬為20—22μm。該藻株與本研究中的東海藻株單細(xì)胞個體大小相近,可能是實驗室培養(yǎng)條件沒有達(dá)到最佳或是細(xì)胞處于生長前期所致。阿拉伯灣分離的多環(huán)旋溝藻藻株橫溝繞細(xì)胞1.6—1.9圈(Richlenet al,2010),而報道的馬來西亞沙巴州的藻株橫溝繞細(xì)胞近兩圈,與東海藻株相似。棒狀葉綠體對區(qū)分多旋旋溝藻與相似種褐色旋溝藻(Cochlodinium fulvescensIwataki,Kawami and Matsuoka)和卷曲旋溝藻(Cochlodinium convolutumKofoid and Swezy)至關(guān)重要。多環(huán)旋溝藻東海藻株的葉綠體為棒狀,且呈簇狀并行分布。此外,多環(huán)旋溝藻的頂溝呈 U形,且在細(xì)胞的背面與縱溝的延伸部分相連。在被描述的頂溝形態(tài)中,裸甲藻馬蹄狀的頂溝和多環(huán)旋溝藻的有些相似(Iwatakiet al,2010)。

Shao等(2004)從分子方面很好地證實了旋溝藻(Cochlodinium)與裸甲藻(Gymnodinium)、前溝藻(Amphidinium)、環(huán)溝藻(Gyrodinium)、卡爾藻(Karlodinium)及凱倫藻(Karenia)有明顯的差異。多環(huán)旋溝藻與殺魚費氏藻(Pfisteria piscicidaSteidinger and Burkholder)和紅色赤潮藻(Akashiwo sanguineaG.Hansen and Moestrup)聚成一支,更親近些?；贚SU rDNA所做的系統(tǒng)進(jìn)化分析可區(qū)分旋溝藻屬的多環(huán)旋溝藻和褐色旋溝藻,且褐色旋溝藻是多環(huán)旋溝藻的姐妹群,親緣關(guān)系較近(Iwatakiet al,2008)。有研究指出,核糖體大亞基D1—D3區(qū)適用于多環(huán)旋溝藻種內(nèi)藻株間水平的鑒定(Kiet al,2008)。本實驗選取 LSU rDNA D1—D3區(qū)作為分子指標(biāo)來區(qū)分多環(huán)旋溝藻藻株不同的地域亞型,通過系統(tǒng)進(jìn)化分析比較得出多環(huán)旋溝藻東海藻株(LAMB110745)屬于東亞型。

多環(huán)旋溝藻為有毒有害赤潮藻,加之其在全球的擴張,對沿海區(qū)的漁業(yè)、生態(tài)環(huán)境和旅游業(yè)造成嚴(yán)重影響,已引起各國研究者的廣泛關(guān)注。但是因其在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與旋溝藻屬其他藻種相似,且這些藻很難進(jìn)行培養(yǎng),所以很難精確地對其進(jìn)行分類鑒定。本研究對多環(huán)旋溝藻東海藻株進(jìn)行了光學(xué)形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)進(jìn)化方面的分析,而關(guān)于其個體生態(tài)學(xué)、毒理學(xué)特性及擴張機制等有待進(jìn)一步研究。

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