史新惠(綜述)，王 芳(審校)

(國家臨床檢驗重點專科 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，南京 210029)

細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的高度保守的細胞主動死亡過程，它調(diào)控機體的生長發(fā)育，維持組織同源性。凋亡過程的紊亂,參與了包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生、發(fā)展。肺癌是常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤之一，細胞凋亡的紊亂同樣在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，為深入了解肺癌細胞凋亡過程紊亂的分子機制，該文對肺癌中幾種重要的凋亡分子進行綜述。

1 細胞凋亡與腫瘤

細胞凋亡是受基因控制的一種程序性的死亡過程，機體可以通過凋亡清除體內(nèi)異常的細胞，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止疾病的發(fā)生。而凋亡抑制或缺失則會引起疾病，如腫瘤、自身免疫性疾病等。能引發(fā)凋亡的信號途徑有多個，如死亡受體途徑，線粒體途徑，核介導的凋亡途徑[胱天蛋白酶(caspase)2,p53]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的凋亡途徑，溶酶體介導的凋亡途徑，其中死亡受體途徑和線粒體途徑是研究比較多的凋亡途徑。參與這些途徑的某些重要凋亡相關分子一旦發(fā)生缺失或者突變，將導致凋亡過程的紊亂而導致疾病的發(fā)生。

研究表明腫瘤細胞涉及凋亡通路中多種分子的改變，包括B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma，Bcl)-2家族促凋亡和抑凋亡基因表達失衡、抑癌基因p53突變或缺失[1]、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)的異常表達，死亡受體的改變及caspase活性的改變等[2]。研究證實，結腸癌和胃癌中存在Bax和Bak突變，Bax缺失加速了p53突變型小鼠模型中腦腫瘤的增長；Bid缺失小鼠更容易發(fā)生慢性單核細胞白血病[3]。Bcl-2不僅在B細胞淋巴瘤，還在其他多種腫瘤(如霍奇金淋巴瘤、腎細胞癌及乳腺癌)中過表達，且與腫瘤的侵襲性、低存活率和內(nèi)分泌治療抵抗有關[4]。此外，原發(fā)性肝癌有死亡受體分子CD95的缺失；在79%的侵襲性食管癌患者中只有不到5%的食管癌細胞中有CD95分子，且其與浸潤深度和淋巴結轉移具有相關性；在成人T細胞淋巴瘤中有CD95突變，在結腸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和黑色素瘤中也都存在CD95表達下調(diào)。而相應的死亡受體配體分子FasL則在很多腫瘤中過表達，如原發(fā)性肝癌、食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、星形細胞瘤、轉移性結腸癌及胃癌等[5]。研究還證明，在黑色素瘤、白血病、膠質(zhì)母細胞瘤和宮頸癌等癌細胞中有凋亡蛋白酶活化因子1的下調(diào)[6]。

2 肺癌中的凋亡相關分子

肺癌是常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤之一，每年全世界因肺癌導致的死亡患者有140萬，約占所有惡性腫瘤死亡的18%[7]。同其他惡性腫瘤一樣，肺癌的發(fā)生是一個長期的多因素形成的分階段的過程，包括癌基因的激活，腫瘤抑制基因的失活，以及凋亡調(diào)節(jié)和DNA修復基因的改變等，其中細胞的增殖與凋亡之間的失衡，即細胞凋亡的紊亂性發(fā)生在肺癌發(fā)展中起到重要作用。而凋亡的發(fā)生則是受到促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白等因素綜合調(diào)控作用的結果。現(xiàn)就肺癌細胞中幾種重要的凋亡相關分子進行具體闡述。

2.1Caspase家族 Caspase家族蛋白是凋亡過程關鍵的執(zhí)行者之一，在細胞中以酶原的形式合成，在凋亡誘導信號的刺激下通過特異性的剪切發(fā)生活化級聯(lián)反應，最終作用于細胞內(nèi)一系列結構蛋白和功能蛋白，導致凋亡的發(fā)生。在死亡受體途徑介導的凋亡中，死亡受體信號導致caspase-8的活化，活化的caspase-8激活效應caspase，如caspase-3、-6、-7，同時caspase-8、-10的活化可以促進線粒體途徑的激活。在線粒體途徑介導的凋亡中，caspase的活化是由細胞色素C的釋放所啟動，多種不同的凋亡刺激信號誘導線粒體細胞色素C的釋放，細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1結合而募集并活化caspase-9，進而活化caspase-3凋亡效應蛋白。

Sirzén等[8]利用16種肺癌細胞系研究了小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的前體caspase-2、-3、-6、-7、-9的表達，觀察到SCLC和NSCLC之間沒有差別，然而，前體caspase-1、-4、-10只在NSCLC細胞系表達，前體caspase-8只在NSCLC細胞系中表達(除SCLC細胞系U1285)，而前體caspase-3在SCLC和NSCLC均被檢測到。因此，直接活化caspase-3介導的凋亡或許是治療肺癌的有效策略。Putt等[9]首先發(fā)現(xiàn)了一種小分子，即PAC-1，可以直接活化前體caspase-3，通過誘導凋亡能顯著抑制肺癌細胞的增殖。

Caspase-9是由CASP9基因編碼，表達兩種相互對抗的蛋白質(zhì)亞型，促凋亡的caspase-9a和促生存的caspase-9b。Caspase-9b缺乏催化活性，但仍保留關鍵的相互作用的結構域，即caspase募集結構域和凋亡體蛋白相關因子1結構域。Caspase-9b通過競爭性結合凋亡體而抑制caspase-9a的活化，并可能通過與caspase-9a形成異二聚體,使caspase-9a不能發(fā)生自身活化。Shultz等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在很多NSCLC腫瘤患者中caspase-9a/9b mRNA的比值極大降低，caspase-9a的活性顯著減小，而caspase-9b在NSCLC細胞的致瘤活性和化療敏感性上發(fā)揮重要作用，這為針對肺癌相關的caspase-9b的特異性靶向治療提供了理論依據(jù)。

2.2Bcl-2家族蛋白 Bcl-2家族蛋白是凋亡重要的調(diào)節(jié)因子，它的抗凋亡和促凋亡成員決定著細胞的生存和死亡。Bcl-2家族蛋白在線粒體水平發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡的作用。Bax和Bak是促凋亡蛋白，接收到死亡信號后可以在線粒體膜上通過形成寡聚體，導致細胞色素C從線粒體釋放，直接誘導凋亡，線粒體凋亡途徑可以被抗凋亡的Bcl-2亞家族成員，如Bcl-2和Bcl-xL通過作用于Bax和Bak所抑制。研究表明Bcl-2在非小細胞肺癌和小細胞肺癌中過度表達[11]。Joseph等[12]研究證實，Bcl-2蛋白在SCLC(65%～90%)中的表達遠遠高于在NSCLC(15%～46%)中的表達，且鱗癌中的表達水平遠高于在腺癌中的表達。由于Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax的比值可作為肺癌治療中的預測指標。與NSCLC相比，SCLC中Bax的低表達導致Bcl-2/Bax比值升高，然而這一比值與降低的凋亡指標沒有確切的相關性。

研究還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2轉染的SCLC細胞系對于抗癌藥物引起的凋亡具有明顯的抵抗性，而轉染了Bcl-2寡聚核苷酸反義引物的SCLC和NSCLC細胞系則表現(xiàn)出對藥物促凋亡的敏感性[13]。這些結果表明，抑制Bcl-2蛋白可以抑制癌細胞的生存使之死亡。目前已有很多Bcl-2家族抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，例如ABT-263(生根粉263，Navitoclax)是一種有效的Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑，與Bcl-2和Bcl-xL有很高的親和性[14]。Chiappori等[15]在研究中表明，奧巴克拉(obatoclax)作為一種Bcl-2抑制劑，在與卡鉑-依托泊苷聯(lián)合應用時能夠有效提高對SCLC腫瘤細胞的殺傷作用，可進一步應用于今后SCLC治療的研究中。

2.3IAP家族 人類基因組編碼8種不同的IAP，其中XIAP、cIAP1和cIAP2含有三個桿狀病毒重復序列(baculovirus-IAP repeat，BIR)結構域，是強有力的細胞死亡抑制劑。最近研究報道，XIAP是唯一能夠直接抑制caspase水解活性的IAP，cIAP1和cIAP2的抗凋亡潛力依賴于它們的E3泛素化連接酶活性[16]。

研究表明，在包括肺癌在內(nèi)的幾種腫瘤細胞中均可檢測到過表達的IAPs，其中存活蛋白在肺癌中呈高表達[17]。在NSCLC的患者中，大部分(85.5%)腫瘤標本發(fā)現(xiàn)有存活蛋白基因轉錄，而對照組(組織病理學正常的肺癌標本)中只有12%有存活蛋白基因轉錄[17]。跟其他IAP蛋白一樣，存活蛋白也能抑制終末效應caspase-3、caspase-7，它的缺失和肺癌良好的預后有相關性[17]。另有研究表明，凋亡抑制蛋白中的存活蛋白在NSCLC患者血清中與健康對照相比沒有升高，而在化療中發(fā)現(xiàn)存活蛋白表達水平降低，尤其是對化療敏感的患者[18]。研究還表明，在手術治療后的NSCLC存活蛋白的表達是病情惡化的預后因素[19]。抑制存活蛋白的表達能顯著提高NSCLC患者的總體存活率，因此存活蛋白是肺癌治療的重要靶點。YM 155是一種存活蛋白抑制劑，可特異性抑制存活蛋白 mRNA水平和蛋白水平的表達[20]，YM 155治療可能與促進caspase介導的凋亡有關。另外，以XIAP為靶點的治療也已展現(xiàn)出抗肺癌細胞活性的潛力[21]。

2.4p53突變 腫瘤抑制基因p53位于人第17染色體的短臂，編碼在G1期阻斷細胞周期的核蛋白并通過轉錄活化多種其他抑制生長和誘導凋亡的基因來誘導細胞凋亡，其在細胞周期檢測點、凋亡及DNA修復和重組中發(fā)揮至關重要的作用[22]。p53在凋亡中的作用主要是轉錄活化某些促凋亡的Bcl-2家族蛋白，包括Bax、Puma和Noxa等。另外，p53在細胞質(zhì)中可直接作用于Bax/Bak，從而導致線粒體透化作用[23]。p53也可以誘導很多死亡效應器的表達，并促進死亡受體(CD95、死亡受體5)和線粒體(凋亡蛋白酶活化因子1、BAX)凋亡通路的活化。因此，p53的失活可能是腫瘤(包括肺癌)最常用的防止發(fā)生凋亡的方法。

p53基因突變發(fā)生在60%～70%肺鱗癌，50%～70%肺腺癌和75%小細胞肺癌中[24]。p53基因突變在吸煙相關的肺癌中比從未吸煙的肺癌中更普遍存在，吸煙相關的肺癌以高頻率的異位突變?yōu)樘卣?，從未吸煙的肺癌則以高比例的轉換突變?yōu)樘卣鱗25]。在p53突變的肺癌細胞中利用反轉錄病毒p53載體恢復野生型p53基因的表達，可以抑制癌細胞生長并誘導細胞凋亡。

2.5死亡受體分子 死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族，它們有相似的富含半胱氨酸的胞外結構域，胞內(nèi)部分都含有約80個氨基酸殘基組成的死亡結構域，其家族成員包括Fas/CD95、DR5、DR4、DR3和腫瘤壞死因子受體1等。它們與相應的配體結合后聚合形成三聚體，通過一系列的信號轉導過程，將凋亡信號向細胞內(nèi)部傳遞，最終引起細胞凋亡的執(zhí)行者caspase家族的活化，這些蛋白酶剪切相應的底物，使細胞發(fā)生凋亡。

死亡受體的改變在腫瘤，尤其是在導致腫瘤細胞逃避炎性反應的分子機制中有重要意義，死亡受體的減少能夠保護細胞免受炎癥系統(tǒng)的侵襲，而表達上調(diào)的死亡配體能夠殺滅炎性反應的細胞。研究表明，CD95在超過90%的肺癌中表達下調(diào)[26]。CD95信號通路的缺失也可能是死亡誘導信號復合物中其他成分改變而導致的結果。研究表明，在非小細胞肺癌中有Fas死亡結構域相關蛋白突變，且磷酸化Fas死亡結構域相關蛋白與肺腺癌不良預后具有相關性[27]。關于死亡受體在肺癌中的表達及意義還需要更多深入的研究。

3 展 望

對于肺癌分子基礎的不斷研究已經(jīng)使人們對肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中失調(diào)的信號通路網(wǎng)絡有了更深入的認識。進一步對肺癌中凋亡相關分子的表達進行深入地研究，有助于不斷揭示細胞凋亡復雜的分子機制，有助于進一步研究肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子基礎，并且可以對肺癌的發(fā)生過程進行適當調(diào)控，這對于抗肺癌藥物的研制和肺癌的預防和治療有至關重要的作用。

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