劉英姿，董筱萍，程　迪，周鐵忠

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧　錦州　121001）

原花青素A-1體內(nèi)外對豬與小鼠T淋巴細胞亞群的影響

劉英姿，董筱萍，程迪，周鐵忠?

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

為研究從碎米花杜鵑葉中分離得到的化合物原花青素A-1（Proanthocyanidin A-1，簡稱PAA-1）的免疫增強活性，初步從細胞水平上探討其免疫增強機制。體外試驗采用流式細胞術(shù)，檢測PAA-1體外對小鼠脾淋巴細胞T細胞亞群CD 4和CD 8單陽性和雙陽性T淋巴細胞亞群百分率及CD4+/CD 8+比值；體內(nèi)試驗通過飼喂不同劑量的PAA-1后，檢測試驗豬外周血淋巴細胞CD4和CD 8單陽性以及CD 4+/CD 8+比值。結(jié)果證明，體外試驗中同陰性對照組相比，PAA-1能單獨或協(xié)同Con A提升具CD 4+、CD 8+及CD 4+CD 8+表型的T淋巴細胞亞群百分率，提高CD4+/CD 8+的比值；體內(nèi)試驗中飼喂中、高劑量的PAA-1的試驗豬外周血中具有CD 4+、CD 8+表型的T淋巴細胞的百分率及CD 4+/CD8+的比值均有顯著提高。說明PAA-1可通過增加輔助性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞數(shù)量、促進T淋巴細胞的成熟以及增加CD 4+/CD 8+的比值發(fā)揮增強細胞免疫的作用，為其進一步開發(fā)為新型免疫增強劑提供試驗依據(jù)。

原花青素A-1；T淋巴細胞亞群；小鼠；仔豬

原花青素是一種在植物界中廣泛存在的多酚類化合物。國內(nèi)外的一些研究證實，其具有抗氧化、保護心血管、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護肝腎功能等多種藥理活性。國內(nèi)外對原花青素類化合物的研究主要集中在其強的抗氧化活性方面，對于其免疫調(diào)節(jié)活性卻極少報道。

課題組對從碎米花杜鵑提取物乙酸乙酯部分分離得到的化合物原花青素A-1（以下簡稱PAA-1）的免疫調(diào)節(jié)活性進行了測定，證實PAA-1體外能極顯著地刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖，具有免疫增強作用[1]。

為了研究PAA-1刺激淋巴細胞增殖作用的機理，本試驗運用流式細胞術(shù)檢測了PAA-1作用后的小鼠脾臟CD4和CD8單陽性和雙陽性T淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+比值以及體內(nèi)對試驗豬外周血淋巴細胞CD4和CD8單陽性以及CD4+/CD8+比值的影響，從分子水平上分析其免疫增強的作用機理。

1　材料與方法

1.1試驗動物的選擇和分組處理體外試驗：健康Balb/c小鼠，6～8周齡，SPF級，體重20±2 g，雄性，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(吉2003-0001)。

體內(nèi)試驗：于凌海大業(yè)鄉(xiāng)生態(tài)豬場選取30～35日齡的健康斷奶三元雜交仔豬（“杜長大”）40頭，隨機分為4組，每組10頭，其中3個試驗組，1個對照組。3個試驗組分別在日糧中不添加（對照組）、添加2 mg/kg（試驗1組）、4 mg/kg（試驗2組）和8 mg/kg（試驗3組）的PAA-1，連用10 d。4組仔豬經(jīng)驅(qū)蟲后分圈飼養(yǎng)于同一全封閉豬舍，由同一飼養(yǎng)員管理，自由采食和飲水。

1.2PAA-PAA-11的提取方法干燥的碎米花杜鵑Rhododendron spici ferum葉10 kg經(jīng)粉碎后，用70%丙酮水泡樣3次，減壓回收，水相依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓蒸餾（40℃）回收乙酸乙酯萃取部分（600 g）。乙酸乙酯部分用90%甲醇水經(jīng)MCI脫除色素，得浸膏500 g。取500 g浸膏，80∶100目硅膠2 000 g上樣，以氯仿∶丙酮（1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4）梯度洗脫，在氯仿：丙酮7：3段反復(fù)運用各種色譜技術(shù)（硅膠柱色譜，凝膠柱色譜，ods反相硅膠）分離出化合物PAA-1,純度98%以上，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 PAA-1的結(jié)構(gòu)Fig.1　The chem ical structure of proanthocyanidinA-1

1.3主要試驗試劑與儀器胰蛋白酶：Gibco產(chǎn)品，CD4/L3T4-PE、CD8/Lyt-2-FITC熒光標記抗體：Southern Biotech產(chǎn)品；FITC-標記抗豬CD4單抗、PE標記抗豬CD8單抗購自BD公司；溶血素購自Beckman Coul ter公司。2.5%小牛血清-PBS：將2.5 mL小牛血清溶于97.5 mL PBS，混勻用于細胞的洗滌，現(xiàn)用現(xiàn)配；1%甲醛-PBS：將1 mL甲醛溶于99 mL PBS，混勻用于重懸細胞；調(diào)機器用樣品包括每種染料的單陽性細胞和無染料的陰性細胞，上述試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心配制。流式細胞儀：美國BD公司LSRII數(shù)字化分析型流式細胞儀。

1.4小鼠脾淋巴細胞的準備及分組試驗共分為4組，分別為陰性對照組、單藥組、Con A對照組和組合PAA-1組。制備小鼠脾淋巴細胞懸液，加入24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，陰性對照組，每孔再分別加入1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液；單藥組，再加入含有100 mg/L PAA-1的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1 mL，使PAA-1終濃度分別為50mg/L；Con A對照組，每孔再加入1ml含10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培養(yǎng)液；組合PAA-1組加入含100 mg/L PAA-1和10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1 mL，使PAA-1和Con A的終濃度分別為50 mg/L和5 mg/L，每組均設(shè)2個復(fù)孔，每孔溶液終體積為2 mL。

1.5小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)與處理上述細胞放入細胞培養(yǎng)板標記好后，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；收集懸浮及貼壁細胞于離心管中，用低溫冷凍離心機4℃ 1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈；加入2 mL PBS，用移液槍輕輕吹勻，于4℃ 1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈，重復(fù)操作2次；加入1 mL 70%冰乙醇（-20℃預(yù)冷）對樣品進行固定，輕輕吹勻，保存于-20℃待用。

1.6流式細胞術(shù)測小鼠T淋巴細胞亞群取一組按1.5中方法處理好的小鼠脾淋巴細胞，于4℃1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈；用PBS洗2次，棄上清，再加PBS重懸細胞；分別加入熒光標記抗體，CD4/L3T4-PE（劑量為0.2μg/106個細胞），CD8/Lyt-2-FITC（劑量為1μg/106個細胞），4℃避光反應(yīng)30 min；PBS洗1次，以便去除未標記上的熒光抗體；然后加500μL PBS重懸細胞，200目尼龍膜過濾，上流式細胞儀，設(shè)定575 nm和530 nm氬激光強度對小鼠脾臟T淋巴細胞膜表面標志CD4及CD8表達量的變化進行測定，用Becton–Dickinson數(shù)據(jù)分析軟件分析細胞亞群結(jié)果，每個樣品以10 000個細胞計數(shù)，結(jié)果以CD4+CD8―%、CD4―CD8+%、CD4+CD8+%表示PAA-1對小鼠脾中T淋巴細胞各亞群百分率的影響。

1.7流式細胞術(shù)檢測試驗豬外周血T淋巴細胞亞群飼喂PAA-1 10 d后，前腔靜脈抽取試驗豬的全血2 mL，肝素抗凝。取配好的肝素抗凝血100μL，加入相應(yīng)熒光染料染色4℃，15 min，避光；BECKMAN溶血素裂解紅細胞（200μL/管）30℃，30 min；2.5%小牛血清-PBS洗滌1～2次，800～1 000 r/min，離心10 min；1%甲醛-PBS重懸，上機檢測[2]。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)用平均值士標準差（x-±SD）表示，采用SPSS 13.0軟件進行方差分析和Duncan’S多重比較。用P＜0.05或P＜0.01對試驗組與對照組樣本均數(shù)間具顯著性差異進行標識，所有試驗結(jié)果均重復(fù)操作3次。

2　結(jié)果與分析

表1　PAA-1體外對T淋巴細胞亞群的影響Table1　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lymphocytes in vitro

2.1PAA-PAA-11體外對小鼠脾淋巴細胞亞群的影響見表1。

如表1所示，與陰性對照組相比，經(jīng)濃度為50 mg/L PAA-1刺激后，小鼠脾中具CD4+與CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率極顯著增加（P＜0.01）；CD4+CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率在該濃度顯著增加（P＜0.05）；CD4+/CD8+比值也有所提高。PAA-1協(xié)同Con A（PAA-1 50 mg/L+Con A 5 mg/L）作用后與對照組相比，CD4+表型的顯著升高(P＜0.05)；CD4+/CD8+比值雖較Con A對照組低，但仍比對照組高。

PAA-1單獨作用對CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率均略高于PAA-1與Con A協(xié)同作用，這表明PAA-1單獨作用對T淋巴細胞表達CD4+/CD8+的影響好于與有絲分裂原共同作用，說明PAA-1本身就具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性。

2.2飼喂PAA-PAA-11對試驗豬外周血T淋巴細胞亞群的影響見表2。

表2　PAA-1體內(nèi)對豬外周血T淋巴細胞亞群的影響Tab le2　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lym phocytes in vivo

表2可見，在飼料中添加不同劑量的PAA-1 10 d后，對試驗豬進行淋巴細胞亞類檢測，結(jié)果表明，具有CD4＋、CD8＋表型的T淋巴細胞亞群百分率在所有的試驗組均高于對照組。其中試驗1組CD4＋亞群顯著高于對照組（P＜0.05）；而試驗2、3組極顯著高于對照組（P＜0.01），試驗2,3組之間差異不顯著。試驗1、2組CD8＋亞群多于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗3組顯著高于對照組（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值的變化：試驗2、3組顯著高于對照組（P＜0.05），試驗1組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

3　討論

3.1CD4和CD8是T淋巴細胞膜上最關(guān)鍵的分化抗原。CD4主要表達于輔助性T細胞，具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性、輔助B細胞產(chǎn)生抗體、分泌細胞因子；CD8主要分布在細胞毒性T淋巴細胞和抑制性T淋巴細胞表面，有免疫抑制和細胞毒性的作用[3]。 CD4+/CD8+的比值是一重要的評估機體免疫狀態(tài)的依據(jù)[4]。體內(nèi)外試驗均證實，PAA-1能提高CD4+/ CD8+的比值，具有免疫增強作用。

3.2流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，體外實驗中同陰性對照組相比，PAA-1單獨作用能極顯著提升具CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率（P＜0.01）；PAA-1協(xié)同Con A作用，也能使CD4+與CD4+CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率顯著升高（P＜0.05），而且對CD4+/CD8+的比值均有提升作用；體內(nèi)試驗中飼喂中、高劑量PAA-1的試驗豬外周血中具有CD4+、CD8+表型的T淋巴細胞的百分率均顯著或極顯著提高了（P＜0.05），CD4+/ CD8+的比值也有顯著提高（P＜0.05）。說明PAA-1通過增加具輔助性功能的T淋巴細胞數(shù)量以及細胞毒性T淋巴細胞數(shù)量，促進T淋巴細胞的成熟以及增加CD4+/CD8+的比值來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

[1]劉英姿，羅有梁，周鐵忠.碎米花杜鵑原花青素A-1對小鼠免疫細胞的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（2）∶45-48.

[2]張紅英，王學(xué)兵，崔保安，等.山藥多糖對PRRSV滅活苗免疫豬抗體和T淋巴細胞亞群的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（2）：236-238.

[3]劉廷，鞠玉琳，李楊，等.中藥復(fù)方連黃對小鼠T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+的影響[J].四川動物，2009，28（1）：115-117.

[4]屈雪琪，趙建增，梁智選，等.流式細胞術(shù)檢測不同試驗條件對豬T淋巴細胞亞群的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（4）∶101-104.

（編輯：韓斌）

Effecton T cellsubset from pigletand Balb/cm ice ofproanthocyanidin A-1

Liu Yingzi,Dong Xiaoping,Cheng Di,Zhou Tiezhong*
（Liaoning Medical University，LiaoningJinzhou121001）

Proanthocyanidin A-1(PAA-1)was isolated f rom Rhododendron spiciferum in ethylacetate.To prel iminary study the mechanism of immuno-enhancing activity of PAA-1 in cel l level,ratio of two main lymphocyte T subsets(CD4+cel ls and CD8+cel ls)were detected by f low cytometer. The lymphocyte T came f rom mice in vit ro and peripheral blood lymphocyte,thepiglets were fed with PAA-1.The resul ts showed that PAA-1 can elevate the CD4+,CD8+and CD4+CD8+cel l populations alone or with Con A and elevate the ratio of CD4+/CD8+in vit ro,and enhance CD4+,CD8+cel l populations and the ratio of CD4+/CD8+in high dose groups.PAA-1 play a role in immune regulation by increasing the number of T helpers,T cytotoxic/suppressors and promote lymphocyte T maturation.

Proanthocyanidin A-1;T cel l subset;Balb/c mice;Piglet

R285.5

：B

：1672-9692(2014)10-0001-04

2014-09-01

劉英姿（1976-），女，博士，副教授，主要從事中藥免疫研究。

周鐵忠（1964-），男，博士，教授，研究方向為動物及人獸共患疫病防治。

遼寧省自然科學(xué)基金項目：《表兒茶素免疫活性及其對免疫抑制小鼠影響的研究》項目編號：2013022047；遼寧醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項目Y2012B010