張文婷，王曉元(綜述)，李方江(審校)

(1.河北北方學(xué)院研究生部，河北 張家口 075000； 2.河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 張家口 075000)

近年來(lái)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病成為全球發(fā)病率最高的疾病，再灌注治療是該疾病的主要治療手段[1]。但與之相關(guān)的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)成為臨床心臟病學(xué)的重要問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外對(duì)此展開的一系列研究均表明，在缺血∕再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后施加不同的處理方式及人為誘導(dǎo)因素，可有效抵抗MIRI[2-3]。這無(wú)疑為進(jìn)一步探討MIRI的防治措施，解決心血管再灌注治療較為嚴(yán)重的并發(fā)癥開辟了一條新的途徑?，F(xiàn)對(duì)缺血后適應(yīng)(ischemic post conditioning，IPOC)及藥物后處理(pharmacologic post conditioning，PPOC)對(duì)MIRI的保護(hù)作用的研究現(xiàn)狀及其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 IPOC對(duì)MIRI的保護(hù)作用

Zhao等[4]首次系統(tǒng)闡述了IPOC，即在缺血損傷后的心肌恢復(fù)血流再灌注后立即重復(fù)數(shù)次予以短暫的I/R處理，能提高心肌對(duì)之前較長(zhǎng)時(shí)間I/R的耐受性，從而減輕MIRI，稱之為IPOC。該研究建成了犬的MIRI模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與缺血1 h后立即持續(xù)開通3 h的對(duì)照組相比，IPOC組的心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡顯著減少，心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)顯著減輕，心律失常的發(fā)生率亦顯著降低。分析IPOC可能通過(guò)減少氧自由基生成和抑制中性粒細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)再灌注早期冠狀動(dòng)脈動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，減輕心肌細(xì)胞水腫，防止冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷，達(dá)到保護(hù)心肌的作用。隨后有很多實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)的研究，多得出與Zhao等[4]研究相似的結(jié)論，極大地提高了IPOC的臨床可行性[5-6]。Laskey等[7]報(bào)道，在給10例急性心肌梗死患者行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)時(shí)首次運(yùn)用了IPOC，IPOC組心電圖ST段抬高的程度顯著降低，ST段回落的速度更快，并且冠狀動(dòng)脈血流速度儲(chǔ)備顯著改善。薛楓[8]運(yùn)用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)心肌灌注顯像和心臟超聲檢驗(yàn)等進(jìn)一步證實(shí)IPOC的心臟保護(hù)作用，IPOC能顯著減少心肌梗死面積及心肌壞死標(biāo)志物、炎性反應(yīng)標(biāo)志物的水平，并且有長(zhǎng)期效應(yīng)。劉晨[9]通過(guò)檢測(cè)心肌呈色分級(jí)及心室收縮功能等表明，IPOC可以改善冠狀動(dòng)脈血流速度及心肌灌注水平，能夠顯著減輕ST段抬高型急性心肌梗死患者急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈治療術(shù)中MIRI，顯著減小心肌梗死面積，改善左心室功能，其機(jī)制考慮與減少活性氧類的釋放、作用于線粒體KATP通道、抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的釋放有關(guān)。田濤等[6]研究亦表明，IPOC通過(guò)激活線粒體鉀ATP通道從而發(fā)揮減輕MIRI的作用，IPOC組動(dòng)物較I/R組左心室收縮壓顯著升高，左心室舒張末期壓顯著降低，血漿肌酸激酶及丙二醛水平顯著降低，心肌梗死的面積顯著縮小。IPOC是臨床最為實(shí)用且相關(guān)研究可行性較大的處理方式，臨床可將該方式與PPOC疊加，達(dá)到最佳治療效果。

2 PPOC對(duì)MIRI的保護(hù)作用

Tsang等[10]發(fā)現(xiàn)在不同的干預(yù)時(shí)間(再灌注期間或再灌注后)給予藥物可對(duì)MIRI起到保護(hù)作用，即PPOC，具有與IPOC相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。基礎(chǔ)研究認(rèn)為，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑類降壓藥物(如苯那普利)、KATP通道開放劑類藥物、阿片肽類鎮(zhèn)痛藥(如舒芬太尼)、全身麻醉類藥物(如異氟烷)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑類藥物(如辛伐他汀)、M膽堿受體阻滯劑山莨菪堿以及多種中成藥物(如復(fù)方丹參滴丸、川芎嗪及參附注射液)除其相應(yīng)的藥理學(xué)作用外都有類似的MIRI保護(hù)作用。

2.1西藥后處理

2.1.1血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑類降壓藥物 常用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑有卡托普利、依那普利、苯那普利等。吳慧穎等[11]研究發(fā)現(xiàn)，苯那普利后處理通過(guò)作用于大鼠MIRI后表達(dá)增強(qiáng)的炎性分子核因子κB的激活及腫瘤壞死因子α的表達(dá)，從而減輕心臟的炎性反應(yīng)。

常用的血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑有氯沙坦、纈沙坦、坎地沙坦等。Lange等[12]研究發(fā)現(xiàn)，坎地沙坦后處理可能通過(guò)依賴蛋白激酶Cε信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)MIRI保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)表明，坎地沙坦通過(guò)促進(jìn)I/R的小鼠蛋白激酶Cε受體表達(dá)顯著增加，從而誘導(dǎo)對(duì)血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用，減輕MIRI。

Tani等[13]的研究表明，兩組急性心肌梗死接受再灌注治療的患者使用依那普利與氯沙坦治療6個(gè)月后，在計(jì)算左心室射血指數(shù)及左心室舒張容積指數(shù)時(shí)，無(wú)論是依那普利還是氯沙坦在心肌梗死后左心室重構(gòu)過(guò)程中所起的作用均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.2KATP通道開放劑類藥物 尼可地爾是目前臨床上唯一應(yīng)用的有硝酸酯樣作用的KATP通道開放劑。鹿欣等[14]研究顯示，尼可地爾后處理可對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。一方面，尼可地爾通過(guò)作用于線粒體KATP通道，導(dǎo)致線粒體內(nèi)部的除極，鈣負(fù)荷的降低和ATP的保存，進(jìn)而減輕心臟工作負(fù)荷；ATP的消耗減少可使乳酸脫氫酶釋放減少，促進(jìn)缺血后心肌的功能恢復(fù)。另一方面,尼可地爾通過(guò)激活胞質(zhì)鳥苷酸環(huán)化酶致使環(huán)鳥苷酸增多和胞質(zhì)鈣離子減少，增加了鉀離子從細(xì)胞的流出。鈣離子內(nèi)流減少使得再灌注部位心肌早期和晚期除極減少，可減少再灌注心律失常的發(fā)生。

2.1.3鎮(zhèn)痛類藥物 鎮(zhèn)痛藥是一類作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、緩解疼痛的藥物，用于各種原因引起的急慢性疼痛，其中阿片肽類鎮(zhèn)痛藥包括嗎啡、可待因、芬太尼、美沙酮等。Schultz等[15]首次報(bào)道了阿片肽類鎮(zhèn)痛藥在缺血預(yù)處理中誘導(dǎo)心肌保護(hù)的作用。芬太尼是臨床常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，該類藥物主要通過(guò)作用于阿片受體，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)機(jī)制，抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而使突觸前膜遞質(zhì)釋放減少，突觸后膜發(fā)生超極化，最終減弱或阻滯痛覺信號(hào)的傳遞。吳巧玲等[16]研究表明，舒芬太尼后處理可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2基因(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白表達(dá)，影響鈣離子通道的開放，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載及氧自由基的生成，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠MIRI。聶麗霞等[17]研究表明，舒芬太尼通過(guò)作用于蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3途徑從而減輕犬MIRI。

2.1.4全身麻醉類藥物 全身麻醉類藥物是一類通過(guò)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而暫時(shí)引起意識(shí)消失、全身痛覺喪失、遺忘、反射抑制和一定程度的肌肉松弛狀態(tài)的藥物，包括吸入麻醉藥類(異氟烷、恩氟烷等)及靜脈麻醉藥(依托咪酯、丙泊酚等)。劉悅等[18]報(bào)道，吸入性麻醉藥七氟烷通過(guò)作用于磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B信號(hào)途徑，進(jìn)而降低血清肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶的活性、肌鈣蛋白濃度和心肌梗死體積，減輕MIRI。單七氟烷處理組磷酸化的蛋白激酶B/蛋白激酶B和磷酸化的內(nèi)皮型一氧化氮合酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶升高，而七氟烷與磷脂酰肌醇3特異性抑制劑LY294002聯(lián)合應(yīng)用組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明七氟烷對(duì)MIRI具有保護(hù)作用。有研究表明,丙泊酚預(yù)處理對(duì)在體大鼠心臟的MIRI模型具有保護(hù)作用[19]。Sun等[20]研究表明，丙泊酚通過(guò)對(duì)大鼠離體心臟一氧化氮合成酶活性的正調(diào)節(jié)來(lái)改善心肌I/R后的心臟功能，該藥物通過(guò)作用于一氧化氮體系實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用。

2.1.53-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑類藥物 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑也稱他汀類藥物，包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀等。Szarszoi等[21]證實(shí)，在大鼠MIRI早期使用辛伐他汀能降低心肌損傷，其機(jī)制可能是辛伐他汀通過(guò)減輕氧自由基的生成，抑制超氧化物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。此后亦有研究表明，辛伐他汀通過(guò)上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/Bcl-2表達(dá)，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/Bcl-2相關(guān)X蛋白表達(dá)，起到抗細(xì)胞凋亡作用，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，減輕MIRI[22]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物通過(guò)磷酸化的蛋白激酶B信號(hào)途徑上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶，從而減輕兔MIRI[23]。

2.1.6M膽堿受體阻滯劑類 M膽堿受體阻滯劑的代表藥物有阿托品，山莨菪堿(654-2)等。近年來(lái)研究表明，山莨菪堿通過(guò)減輕血管痙攣及改善經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈治療術(shù)中的慢血流現(xiàn)象減輕MIRI[24]。王政等[25]研究亦表明，山莨菪堿后處理組通過(guò)抑制氧自由基和改善微循環(huán)等作用機(jī)制，可顯著降低再灌注心律失常、低血壓狀態(tài)、慢血流的發(fā)生率。實(shí)驗(yàn)證明，山莨菪堿組與對(duì)照組比較，心律失常的發(fā)生率顯著降低，肌酸激酶同工酶和心肌肌鈣蛋白峰值出現(xiàn)時(shí)間顯著提前；術(shù)后30 min及術(shù)后24 h時(shí)，山莨菪堿組血清中超氧化物歧化酶高于對(duì)照組；丙二醛低于對(duì)照組。李圣洪等[26]研究表明，山莨菪堿通過(guò)下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase-1表達(dá)，抑制促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素18，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)的發(fā)生。

目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，西藥后處理減輕MIRI的機(jī)制主要是抑制再灌注早期的氧自由基產(chǎn)生、炎性介質(zhì)的釋放、鈣超載、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放及促進(jìn)一氧化氮合酶表達(dá)、KATP通道開放等，因此新藥的臨床開發(fā)可循照這幾個(gè)基本方向展開。

2.2中藥后處理 近年來(lái)，部分學(xué)者對(duì)中藥后處理做了一些探索性研究，發(fā)現(xiàn)參附注射液、川芎嗪等中藥后處理均能顯著減小心肌梗死面積，對(duì)大鼠MIRI具有保護(hù)作用。但中藥后處理對(duì)MIRI保護(hù)作用的研究剛起步，缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，具體的作用機(jī)制尚待明確。Wei等[27]研究證實(shí)，人參皂甙一方面可清除MIRI后釋放的氧自由基，抑制機(jī)體炎性因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8的生成和釋放，減輕炎性反應(yīng)；另一方面，通過(guò)阻止細(xì)胞鈣通道，防止鈣超載，改善血液流變性，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，達(dá)到改善微循環(huán)的目的。辛毅等[28]研究顯示，參附注射液后處理通過(guò)激活線粒體細(xì)胞膜上Bcl-2蛋白，調(diào)節(jié)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少細(xì)胞內(nèi)凋亡促進(jìn)因子1及細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的caspase-3表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕MIRI的目的。呂磊等[29]研究表明，川芎嗪預(yù)處理能減少大鼠MIRI的炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶表達(dá)、增加內(nèi)源性一氧化氮水平有關(guān)。與I/R組相比，川芎嗪預(yù)處理通過(guò)增加一氧化氮水平及心肌內(nèi)皮型一氧化氮合酶信使RNA和蛋白的表達(dá)水平能減少心肌白細(xì)胞浸潤(rùn)，增加心肌組織超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛水平及髓過(guò)氧化物酶活性，降低白細(xì)胞介素1β水平，非選擇性一氧化氮合酶抑制劑左旋-硝基-精氨酸甲酯通過(guò)取消川芎嗪所致的內(nèi)皮型一氧化氮合酶信使RNA和蛋白表達(dá)水平的增加，從而顯著抑制上述指標(biāo)的變化。

PPOC作用于相關(guān)的I/R反應(yīng)介質(zhì)及途徑，部分機(jī)制已明確，故臨床實(shí)踐可將其與IPOC良好的結(jié)合，有廣闊的發(fā)展空間。

3 小 結(jié)

盡管IPOC及PPOC對(duì)MIRI的保護(hù)作用的相關(guān)研究及機(jī)制的討論已取得了一定成果，但仍有一些問(wèn)題亟待解決。首先，不同動(dòng)物種屬，其詳細(xì)的MIRI機(jī)制尚不清楚，臨床采用何種處理方式，后處理保護(hù)作用的確切信號(hào)機(jī)制和最佳分子信號(hào)作用靶點(diǎn)均有待明確。其次，PPOC目前只是停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，將其應(yīng)用于臨床有效的時(shí)間窗、對(duì)心肌保護(hù)的近期和遠(yuǎn)期效果及作用機(jī)制等都還有待于進(jìn)一步研究。再次，將IPOC與PPOC結(jié)合廣泛應(yīng)用于臨床尚需要大量的前瞻性、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。隨著基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床病例實(shí)踐的相結(jié)合，不同處理方式對(duì)MIRI的保護(hù)作用應(yīng)用于臨床有廣泛的前景，相關(guān)的一系列研究成果必將造福廣大心血管疾病患者。

[1] 陸再英,鐘南山.內(nèi)科學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社,274-302.

[2] Shi W,Vinten-Johansen J.Endogenous cardioprotection by ischaemic postconditioning and remote conditioning[J].Cardiovascular Research,2012,94(2):206-216.

[3] Ivanes F,Rioufol G,Piot C,etal.Postconditioning in acute myocardial infarction patients[J].Antioxid Redox Signal,2011,14(5):811-820.

[4] Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):H579-H588.

[5] Andreka G,Vertesaljai M,Szantho G.Remote ischemic post-conditioning protects the heart during acute myocardial infarction in pigs[J].Heart,2007,93(6):749-758.

[6] 田濤,馬賓,王明霞，等.缺血后處理對(duì)減輕兔心肌缺血再灌注損傷作用的研究[J].中華全科醫(yī)學(xué),2012,10(2):170-176.

[7] Laskey WK.Brief repetitive balloon occlusions enhance reperfusion during percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction:a pilot study[J].Catheter Cardiovasc Interv,2005,65(3):361-367.

[8] 薛楓.心肌缺血后適應(yīng)的基礎(chǔ)和臨床研究[D].蘇州：蘇州大學(xué),2010.

[9] 劉晨.缺血后適應(yīng)在急性ST段抬高性心肌梗死急診介入治療中對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2011.

[10] Tsang A,Derek JH,Mihaela M,etal.Post conditioning a form of "modified reperfusion"protects the myocardium byactivating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway[J].Circulation Research,2004,95(3):230-232.

[11] 吳慧穎,張英杰.苯那普利后處理對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)心血管病研究雜志,2008,6(4):294-297.

[12] Lange SA,Wolf B,Schober K,etal.Department of internal medicine and cardiology,dresden university of technology,dresden,germany[J].Cardiovasc Pharmacol,2007,49(1):46-55.

[13] Tani S,Nagao K,Anazawa T,etal.Department of cardiology,nihon university surugadai hospital,tokyo.tanishigem[J].Intern Med,2009,48(11):877-882.

[14] 鹿欣,劉立群,陳維寧，等.尼可地爾后處理聯(lián)合預(yù)處理對(duì)離體心肌缺血/再灌注的作用研究[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2007,1(6):28-33.

[15] Schultz JJ,Hsu AK,Gross GJ,etal.Ischemic Preconditioning in the intact rat heart is mediated by dl but not mork opioid receptors[J].Circulation,1998,97(b):1282-1289.

[16] 吳巧玲,沈途,王玲玲，等.舒芬太尼后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2012,32(1):120-123.

[17] 聶麗霞，田首元，孟玉潔,等.JAK2-STAT3通路在舒芬太尼后處理減輕犬心肌缺血再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2012,32(3):367-370.

[18] 劉悅,彭云水,劉雅，等.PI3K-Akt-eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2012,32(3):371-374.

[19] Shin IW,Jang IS,Lee SH,etal.Propofol has delayed myocardial protective effects after a regional ischemia/reperfusion injury in an in vivo rat heart model[J].Korean J Anesthesiol，2010,58(4):378-382.

[20] Sun HY,Xue FS,Xu YC,etal.Propofol improves cardiac functional recovery after ischemia-reperfusion by up regulating nitric oxide synthase activity in the isolated rat hearts[J].Chin Med,2009,122(24):3048-3054.

[21] Szarszoi O,Maly J,Ostadol P,etal.Effect of acute and chronic simvastatin treatment on post-ischemic contractile dysfunction in isolated rat heart[J].Physiol Res,2008,57(5):793-796.

[22] 車中應(yīng),陳還珍.辛伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)療前沿,2011,6(2):26.

[23] 汪蕾,陳紅霞,陳莉，等.不同他汀類藥物治療兔心肌缺血再灌注損傷的療效及機(jī)制探討[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2013,41(2):81-84.

[24] Fu XH,Fan WZ,Gu XS,etal.Effect of intracoronary administration of anisodamine on slow reflow phenomenon following primary percutaneous coronary intervention in patients with acute myocardial infarction[J].Chin Med,2007,120(14):1226-1231.

[25] 王政,劉尚軍,董國(guó),等.山莨菪堿在右冠狀動(dòng)脈心肌梗死急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入時(shí)對(duì)心臟的保護(hù)作用[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2012,31(8):672-675.

[26] 李圣洪,張煜東,郭謙.山莨菪堿對(duì)過(guò)度訓(xùn)練致急性心肌損傷大鼠caspase-1和IL-18表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2012,32(2):211-213.

[27] Wei FJ,Wu Q.Influence of shenfu injection for open heart surgery patients.Inflammatory cytokine during extracorporeal circulation period[J].China Anesth Analg,2005,7(1):23-26.

[28] 辛毅,吳永濤,顧云，等.參附注射液對(duì)缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].心肺血管病雜志,2010,29(3):229-232.

[29] 呂磊,孟慶欣,徐軍，等.川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)及機(jī)制[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2012,20(6):514-518.