孔暉暉，張乾義,2，張 瑩，谷春陽,2，姜永萍，關云濤，陳化蘭,2*

(1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.甘肅農業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070)

H5N1 禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)具有高的致病性[1]，而2009 年爆發(fā)的墨西哥甲型H1NI 流感，雖然傳播效率很高，但其致病性卻只略高于一般的季節(jié)性流感[2]。研究表明，流感病毒的致病性是由多個基因決定的。其中HA 和PB2 基因對流感病毒的致病性具有重要影響[3-4]。同時，NS基因同樣也影響流感病毒的致病性，如H5N1 AIV的NS1 蛋白中S42P 突變可以導致其對小鼠的致病力減弱或對豬(D92E)和雞(V149A)的致病力增強[5-7]。此外，2001 年和2003 年我們從福建省豬體內分離到兩株H5N1 AIV，由于其中一株在NS 基因發(fā)生了15 個氨基酸的連續(xù)缺失導致其對雞的致死性與未發(fā)生缺失的另一株相比顯著降低[8]。

本研究利用反向遺傳技術，將一株H5N1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)的NS 基因替換為我國首例甲型H1N1 流感病毒分離株A/Sichuan/01/2009(SC/01)的NS 基因，拯救出一株H5N1 重組病毒(DK/35-SC/01-NS)，并初步評估了DK/35-SC/01-NS對小鼠的致病性。為進一步研究NS 基因對流感病毒致病性的影響機制奠定了基礎，也為研制弱毒活疫苗提供了一種新的策略。

1 材料和方法

1.1 重組質粒、雞胚及實驗動物 本研究所用重組質粒由本實驗室構建和保存；所用的9～11 日齡雞胚購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；6 周齡SPF 雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑及引物 TRlzol LS RNA 提取試劑盒與反轉錄酶均購自Invitrogen 公司；膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；DNA 測序試劑盒購自Applied Biosystems 公司；擴增及測序引物(如讀者需要引物序列信息作者可以提供)。

1.3 病毒拯救及病毒滴定 參照文獻[9]的方法進行病毒拯救。病毒尿囊液用PBS 10 倍倍比稀釋為10-5～10-10梯度，每個滴度接種5 枚9～11 日齡雞胚，0.1 mL/胚，37 ℃孵育48 h，后收集尿囊液進行血凝實驗，用Reed-Muench 算法計算EID50。

1.4 MLD50測定試驗 測定病毒的EID50后，用PBS 將病毒尿囊液10 倍倍比稀釋(107EID50/50 μL～101EID50/50 μL)。經鼻腔接種5 只小鼠，每天稱重，記錄小鼠的存活情況。

2 結果與討論

2.1 病毒拯救及EID50測定 按反向遺傳操作方法分別拯救DK/35 和DK/35-SC/01-NS 病毒，收集病毒尿囊液，對其各基因節(jié)段進行RT-PCR 擴增及測序。測序結果表明，所拯救病毒的序列與預期相符。測定所拯救病毒的EID50，結果表明DK/35-SC/01-NS在雞胚上的復制滴度高達9.3 logEID50，DK/35 為7.7 logEID50，表明SC/01 的NS 基因能夠與DK/35很好的兼容。

2.2 MLD50測定試驗 將DK/35 和DK/35-SC/01-NS的病毒尿囊液10 倍梯度稀釋(107EID50/50 μL～101EID50/50 μL)，經鼻腔感染5 只6 周齡左右的BALB/c小鼠，連續(xù)觀察14 d，記錄體重變化及死亡情況。DK/35(圖1)和DK/35-SC/01-NS(圖2)的MLD50分別為2.6 log 10 EID50和5.9 log 10 EID50。兩者間的致死劑量相差高達2 000 倍。研究表明NS 具有拮抗干擾素的作用[5-8]，我們推測SC/01 的NS 基因主要是通過調節(jié)宿主干擾素的產生致弱了DK/35 的毒力。而NS 與宿主相互作用改變致病力的具體機制仍需要進一步研究。

圖1 DK/35 鼻腔感染后的致死情況Fig.1 The virus pathogenicity to mice inoculated intranasally with different dose of DK/35

圖2 DK/35-SC/01-NS 鼻腔感染后的致死情況Fig.2 The virus pathogenicity to mice inoculated intranasally with different dose of DK/35-SC/01-NS

流感病毒的致病力與病毒本身的特性以及宿主密切相關，NS 基因是A 型流感病毒的主要致病因子之一。Zhou 等通過改變NS1 蛋白的氨基酸，制備了應對2009 H1N1 流感病毒的弱毒活疫苗[10]，表明通過改變流感病毒的NS 基因制備弱毒活疫苗有很好的應用前景。本研究用SC/01 的NS 基因替換DK/35 的NS 基因，成功的致弱了H5N1 亞型流感病毒，為進一步對致弱機制進行系統(tǒng)的研究提供了材料，也為生產弱毒活疫苗提供了一種新策略和理論支持。

[1]http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/index.html.

[2]Yasushi I,Kyoko S,Maki K,et al.In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses[J].Nature,2009,460:1021-1025.

[3]Hatta M,Gao Peng,Halfmann P,et al.Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1influenza A viruses[J].Science 2001,293(5536):1840-1842.

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[7]Li Ze-jun,Jiang Yong-ping,Jiao Pei-rong,et al,The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses[J].J Virol,2006,80(22):11115-11123.

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[9]馮華朋，鐘功勛，張月梅，等.H5N1 亞型人禽流感病毒A/Anhui/2/2005 株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(2)：135-138.

[10]Zhou Bin,Li Yan,Belser J A,et al.NS-based live attenuated H1N1 pandemic vaccines protect mice and ferrets[J].Vaccine,2010,28(50):8015-8025.