安 偉，肖 雨，張崇文，張明輝，何正侃

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 200433)

2001 年我國(guó)首次從鱖魚(yú)中分離到傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)[1]，并先后完成了病原病理研究[2]及病毒全基因組的測(cè)序工作[3]，該病毒屬于虹彩病毒科細(xì)胞腫大病毒屬，其感染水生動(dòng)物導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率，給鱖魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,亟待建立一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法對(duì)病原進(jìn)行及時(shí)診斷。

熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、能夠定量并且有效解決PCR 污染問(wèn)題，已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫方面廣泛應(yīng)用[4-6]。目前，尚未有應(yīng)用qPCR 技術(shù)對(duì)ISKNV 進(jìn)行檢測(cè)的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)ISKNV Taq-Man qPCR 方法，能夠?qū)SKNV 進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，對(duì)鱖魚(yú)病原的診斷和防控具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 病 毒 ISKNV 由農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動(dòng)植物病原庫(kù)提供；流行性造血器官壞死病毒(EHNV)由連云港出入境檢疫局動(dòng)植物實(shí)驗(yàn)室提供；鯉春病毒血癥病毒(SVC)由深圳出入境檢疫局動(dòng)植物實(shí)驗(yàn)室提供；草魚(yú)呼腸孤病毒(GCRV)由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢所提供。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA 聚合酶、PCR 反應(yīng)液、pMD18-T 載體，探針?lè)晒舛吭噭┖幸约癉NA提取試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Axygen 公司。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中ISKNV 基因組中 MCP 蛋白編碼基因序列(AF371960)，應(yīng)用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條探針。序列為：F：5'-ATGCCAATCATCTTGTTG TAGCC-3'；R：5'-GGTGTCATTTAACGACCTGGT G-3'；Probe：5'-FAM-AGACCCTGACCACGAGTTCC TTGACTT-TAMARA-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段為142 bp。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照DNA 基因組提取試劑盒說(shuō)明提取的ISKNV 基因組為模板，應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增MCP 基因部分片段。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖電泳檢測(cè)?；厥漳康钠慰寺∮趐MD18-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-MCP，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.5 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)qPCR 反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，參照試劑盒中20 μL 體系反應(yīng)要求，篩選引物濃度以及退火溫度等條件，以獲得最低的Ct 值和較高的熒光強(qiáng)度增加值，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性。

根據(jù)測(cè)定重組質(zhì)粒pMD-MCP 的OD260nm值，換算成質(zhì)粒濃度，用雙蒸水10 倍倍比稀釋(1.95×108拷貝/μL～1.95×103拷貝/μL)，以其為模板，根據(jù)優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，利用分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 靈敏性試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pMD-MCP 標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后(1.95×108拷貝/μL～1.95×10 拷貝/μL)進(jìn)行qPCR 和普通PCR 反應(yīng)，每個(gè)梯度濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，以確定這2 種方法的檢測(cè)下限，比較兩種方法的靈敏性。

1.7 特異性試驗(yàn) 提取ISKNV、SVC、EHNV 和GCRV 的cDNA 或DNA 為模板，以建立的qPCR 方法進(jìn)行特異性檢測(cè)，同時(shí)設(shè)無(wú)模板對(duì)照。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pMD-MCP 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋3 個(gè)濃度梯度(1.95×103拷貝/μL，9.75×105拷貝/μL，1.95×106拷貝/μL，每個(gè)梯度設(shè)5 個(gè)重復(fù)，分成3 個(gè)批次(A，B，C)，進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 采用建立的qPCR 方法，對(duì)2012 年上海地區(qū)收集的5 份不同養(yǎng)殖單位疑似患病鱖魚(yú)進(jìn)行ISKNV 檢測(cè)，每份樣品2 個(gè)重復(fù)，初步驗(yàn)證其應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 經(jīng)ISKNV 組織提取病毒DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增MCP 基因部分片段，得到約150 bp 產(chǎn)物(圖1)。將目的基因克隆到質(zhì)粒pMD18-T 中構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序與預(yù)期目的片段完全一致，命名為pMD-MCP。將其作為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，提取的pMD-MCP 檢測(cè)濃度為32.5 μg/mL。

2.2 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)優(yōu)化qPCR 20 μL的反應(yīng)體系：Premix Ex Taq(2×)為10 μL，上下游引物10 μmol/L 各0.4 μL，探針引物10 μmol/L 為0.3 μL，Rox 為0.4 μL，質(zhì)粒模板1 μL，滅菌水7.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃30 s、95 ℃5 s、62 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；62 ℃進(jìn)行熒光檢測(cè)，每個(gè)梯度濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。以10 倍倍比稀釋的pMD-MCP 為模板進(jìn)行qPCR，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)。依據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)與Ct 值的線性關(guān)系，由7500 Software v2.0 軟件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)代表質(zhì)粒模板拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct 值，曲線方程為y=-3.213x+42.884。R=0.994，E=104.742%。

圖1 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid

圖2 qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線和動(dòng)力學(xué)曲線圖Fig.2 Standerd and dynamic curves of qPCR

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒pMD-MCP各稀釋度樣品進(jìn)行qPCR 和普通PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)下限為20 拷貝/μL，Ct 值為34.99±0.15，而普通PCR 法的檢測(cè)下限為1.95×104拷貝/μL(圖3)。

圖3 qPCR(A)與普通PCR(B)敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity tests of qPCR(A)and traditional PCR(B)

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用建立的qPCR 方法對(duì)ISKNV、SVCV、EHNV、GCRV 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明僅ISHNV 病毒核酸有熒光信號(hào)，而其他病毒核酸均無(wú)熒光信號(hào)(圖4)。

圖4 ISKNV qPCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity test of qPCR for ISKNV

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)重組質(zhì)粒稀釋不同的濃度和批次，進(jìn)行數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于0.7 %(表1)。

2.6 臨床病樣的檢測(cè)結(jié)果 將采集的5 份疑似病料樣品分別利用建立的qPCR 和常規(guī)PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，qPCR 能夠檢測(cè)5 份樣品全部為陽(yáng)性，而常規(guī)PCR 只能檢測(cè)出其中的3 份樣品為陽(yáng)性。

表1 qPCR 檢測(cè)ISKNV 批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Intra-and inter-batch reproducibility of qPCR assay for ISKNV

3 討論

目前，解決ISKNV 感染傳播的最有效辦法是采取預(yù)防措施，即對(duì)病毒實(shí)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)預(yù)報(bào)。目前，應(yīng)用常規(guī)PCR、套式PCR、qPCR 以及環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)檢測(cè)水生生物病毒已有相關(guān)報(bào)道[7-9]。其中，qPCR 技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，在重大疫情病原定量檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)并篩選出特異性的引物及探針，優(yōu)化反應(yīng)體系中引物、探針濃度及退火溫度時(shí)間等反應(yīng)條件，建立了ISKNV qPCR 的檢測(cè)方法。其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，回歸系數(shù)達(dá)到0.994，能夠?qū)Σ《究截悢?shù)精確定量檢測(cè)，確定感染程度。靈敏度下限可達(dá)20 拷貝/μL，即可以檢測(cè)到2.1×10-3pg/μL 的病毒核酸，比鄧敏報(bào)道的常規(guī)PCR 方法靈敏度高出1 000 倍[10]。特異性強(qiáng)，與其他幾種魚(yú)類病毒病原無(wú)交叉反應(yīng)，能夠快速準(zhǔn)確的進(jìn)行定性分析。該方法的重復(fù)性好，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于0.7 %，表明該檢測(cè)體系穩(wěn)定，適于大批量的病原樣品檢測(cè)。

采用建立的ISKNV qPCR 方法進(jìn)行臨床疑似病樣的檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)際情況相符，并且敏感性高于普通PCR。該方法從病毒核酸提取到檢測(cè)結(jié)果的完成只需1 h～2 h，顯著提高了檢測(cè)效率，適合在短時(shí)間內(nèi)完成大量樣品的病原學(xué)診斷及檢疫。

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