孟春春，程英杰，李傳峰，王玢瑸，繆秋紅，陳宗艷，吳 潤(rùn)，劉光清

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)醫(yī)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)，又稱兔瘟，是由RHD 病毒(RHDV)引起的一種以急性、高度傳染性、大面積壞死為特征的兔傳染病。OIE 將該病列為必須呈報(bào)疫病，我國(guó)將其列為二類疫病[1]。2009 年國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)將RHDV 劃定為杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)中的成員。RHDV 的基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約7.5 kb，基因組含有兩個(gè)開放閱讀框(ORF)，共編碼9 個(gè)成熟蛋白。其中VP60 為RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是最主要的免疫保護(hù)性抗原[2-3]。

近年研究表明，VP60 蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原決定簇主要分布于兩端[4-5]。因此本研究選取RHDV 衣殼蛋白VP60 兩端的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域A(aa31～aa250)和B(aa472～aa579)，采用融合PCR 的方法將兩個(gè)片段擴(kuò)增拼接并與通用Th 細(xì)胞表位融合，利用pET-30a(+)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RHDV 重組多肽片段AB-Th 重組蛋白，并制備了多克隆抗體，western blot 檢測(cè)顯示特異性良好。將該融合蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔兩次后，能夠完全保護(hù)實(shí)驗(yàn)兔對(duì)抗強(qiáng)毒攻擊，這為下一步研究RHDV 的新型亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 重組質(zhì)粒pBL-RHDV(含有RHDV 全長(zhǎng)基因組cDNA 序列)和RHDV-VP60 原核表達(dá)蛋白均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所劉光清課題組構(gòu)建并保存[6]；pET-30a(+)載體購(gòu)自Novagen 公司；E.coli JM109 和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；r Taq DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa 公司；DAB 顯色液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Pfu DNA 聚合酶、細(xì)菌蛋白抽提劑和抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體(MAb)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；CellTiter 96 AQ One solution Cell proliferation assay kit 購(gòu)自Promega 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)和山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；2 月齡非免疫新西蘭大白兔購(gòu)自上海奉賢輝煌養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的RHDV JX/97 株基因組序列(DQ205345)設(shè)計(jì)擴(kuò)增AB-Th 基因的兩對(duì)引物，P1：5'-ATGTCCGTCGCGGATGCG CCCGGC-3'；P2：5'-ACTGCCGCCGCCGCC ACCAG TGAGGACTGGGGTCGTG-3'；P3：5'-GGCGGCGGC GGCAGT CCCAGCTGCGGCGTTGACGTC-3'；P4：5'-AGATTCGAACAGGATACCTTCGATTTTGTGAAC GATAACACCTTTGATTTCAGAGATAGAGATAACG TACAGTCAGACATAAGAAAAGCCATTGGTT-3'。

斜體部分為P2/P3 的互補(bǔ)區(qū)，下劃線部分為P4引物所引入的Th 表位，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以pBL-RHDV質(zhì)粒為模板，P1 和P2 擴(kuò)增A 片段，P3 和P4 擴(kuò)增B 片段，然后利用P1 和P4 融合PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 μL，其中模板(A、B)各1.0 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。融合PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)80 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用試劑盒回收目的片段。將純化的AB-Th 基因和pET-30a(+)載體分別用KpnⅠ、Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切，T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆由上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pETAB-Th。

1.4 融合蛋白AB-Th的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將pETAB-Th 轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落至含有卡那的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6 時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE 電泳分析。擴(kuò)大培養(yǎng)表達(dá)AB-Th 重組菌，參照分子克隆第三版方法純化AB-Th 重組蛋白。

1.5 AB-Th免疫原性檢測(cè) 將純化的AB-Th 融合蛋白免疫新西蘭兔(60 日齡)，400 μg/只，免疫程序?yàn)椋菏状蚊庖? 周后，進(jìn)行第2 次免疫，以后再分別間隔2 周進(jìn)行第3 次和第4 次加強(qiáng)免疫。第4 次加強(qiáng)免疫后1 周，經(jīng)心臟采血，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訟B-Th 融合蛋白為抗原，將待檢血清作為一抗(1∶200)，羊抗兔IgG-HRP 作為二抗(1∶5 000)，DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.6 AB-Th免疫效力檢測(cè) 將10 只新西蘭兔隨機(jī)分為兩組，每組5 只；一組使用純化后的AB-Th 融合蛋白按500 μg/只的劑量免疫兩次(皮下注射)，首次免疫兩周后進(jìn)行第2 次免疫；同時(shí)設(shè)立PBS 免疫組為陰性對(duì)照組。分別于免疫前、一免后兩周、二免后兩周采血分離血清，以RHDV-VP60 原核表達(dá)蛋白為包被抗原(5 μg/孔)，實(shí)驗(yàn)兔血清為一抗，過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 為二抗，ELISA 法檢測(cè)VP60 蛋白的抗體水平；同時(shí)分離外周血單核細(xì)胞，使用MTS 法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖情況。二免后第二周每只兔子肌肉注射RHDV 強(qiáng)毒JX/92 株1∶10 稀釋的肝臟研磨液2 mL，每天觀察并記錄死亡兔子情況，連續(xù)觀察14 d。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 以pBL-RHDV 為模板，通過融合PCR 擴(kuò)增出AB-Th 基因，其長(zhǎng)度約為1 kb，與預(yù)期936 bp 相符(圖1)。將基因AB-Th 與pET-30a(+)連接。通過序列測(cè)定，表明構(gòu)建了含有AB-Th 基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒pETAB-Th。

圖1 AB-Th 基因的融合PCR 產(chǎn)物Fig.1 Overlapping PCR products of AB-Th gene

2.2 AB-Th的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及免疫原性檢測(cè)將重組質(zhì)粒pETAB-Th 轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h～3 h，AB-Th 融合蛋白獲得良好的表達(dá)，加上pET-30a 上的His 標(biāo)簽，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為36 ku，與預(yù)期結(jié)果相符?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，AB-Th 融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。參照分子克隆第三版方法分離純化包涵體，獲得純化的AB-Th 融合蛋白(圖2A)。將純化的AB-Th 融合蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔，獲得抗AB-Th 蛋白的多克隆抗體。以1∶200 倍稀釋的該抗體為一抗進(jìn)行western blot 分析，結(jié)果在約36 ku 處出現(xiàn)一條反應(yīng)條帶，表明重組蛋白具有良好的免疫原性(圖2B)。

2.3 AB-Th融合蛋白誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫結(jié)果 采集免疫AB-Th 融合蛋白的兔血清并分離血清，利用ELISA 方法檢測(cè)VP60 蛋白的抗體水平，結(jié)果顯示免疫組與對(duì)照組抗體上升情況差異顯著，實(shí)驗(yàn)兔在一免后兩周就產(chǎn)生了較高的抗體水平，在二免兩周達(dá)到2.5 以上(圖3A)。在每次免疫后的第2 周采集AB-Th 免疫組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔的外周血，分離淋巴細(xì)胞，MTS 法測(cè)定T 淋巴細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示免疫組與對(duì)照組比較差異顯著，表明攜帶Th 通用表位的重組蛋白組可以誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫(圖3B)。

AB-Th 免疫組兔攻毒后連續(xù)14 d 均無死亡并且健康生長(zhǎng)，其保護(hù)率為100 %。14 d 后解剖所有免疫兔，均未出現(xiàn)出血癥狀，肝、肺和腎等臟器正常。而PBS 對(duì)照組在攻毒后96 h 內(nèi)5 只兔子全部死亡，眼觀鼻腔中有泡沫狀出血，眼結(jié)膜充血，剖檢可見肝腫大，黃褐色，質(zhì)脆，表面散在灰白色針尖至粟粒大壞死灶，兩腎有不同程度淤血、變性，心腔內(nèi)積留黑紅色血液和血塊。

圖2 AB-Th 融合蛋白的SDS-PAGE 檢測(cè)(A)和多抗血清的western blot 鑒定(B)Fig.2 Analysis of AB-Th protein expression by SDS-PAGE(A)and polyclonal antiserum activity of AB-Th protein by western blot(B)

圖3 檢測(cè)RHDV VP60 抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖情況Fig.3 Detection of RHDV VP60 antibody increasing and T-Lymphocyte proliferation

3 討論

目前，RHD 已蔓延至我國(guó)絕大多數(shù)省市，給養(yǎng)兔業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于至今尚無RHDV穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系，所以目前廣泛使用的疫苗仍為傳統(tǒng)的組織滅活苗，其存在制作過程中向環(huán)境散毒、疫苗保存過程中易結(jié)塊、注射抗原量難以統(tǒng)一、制備成本的不斷提高等諸多弊端，作為替代組織滅活苗的基因工程亞單位疫苗，既能起到免疫作用，又能很好的解決組織滅活苗存在的生物安全性問題，成為目前研究的熱點(diǎn)。

大量研究結(jié)果證明RHDV 衣殼蛋白VP60 與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了VP60。嚴(yán)維巍和王永山等都通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RHDV 衣殼蛋白VP60，并且免疫實(shí)驗(yàn)均取得了較好的效果[7-8]。Laurent 等通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RHDV VP60蛋白，經(jīng)western blot 和ELISA 試驗(yàn)證明了表達(dá)產(chǎn)物的抗原性[9]。隨后Nagesha 等都通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RHDV VP60 蛋白，并且均觀察到了病毒樣顆粒(VLPs)，經(jīng)免疫試驗(yàn)同樣證明可以產(chǎn)生免疫保護(hù)對(duì)抗RHDV 的攻擊[10]。Boga 等用釀酒酵母表達(dá)了RHDV VP60，實(shí)驗(yàn)兔只需免疫一次重組蛋白后即可抵抗RHDV 的攻擊[11]。由于RHDV 完整的衣殼蛋白分子量偏大，無論用原核表達(dá)系統(tǒng)還是真核表達(dá)系統(tǒng)均存在表達(dá)不穩(wěn)定和表達(dá)量偏低的缺陷，這些均增加了RHDV 亞單位疫苗的生產(chǎn)成本，導(dǎo)致至今尚無商品化的RHDV 基因工程亞單位疫苗。

Torrecuadradan 等表明VP60 中有兩個(gè)主要抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)域，分別位于VP60 蛋白N 端的aa31～aa250和C 端的aa477～aa579 之間，而且N 端的抗原性顯著強(qiáng)于C 端[5]。Viaplana E 等也從另一角度證明了該結(jié)論的正確性，他們將RHDV 的衣殼蛋白VP60分成5 個(gè)相互重疊的片段，分別在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，將重組蛋白分別與自然感染和人工免疫兔的RHDV 抗血清進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示VP60 蛋白氨基端(包括蛋白的前175 個(gè)氨基酸)與抗血清的反應(yīng)最強(qiáng)，而蛋白羧基端則較弱[4]。以上結(jié)果表明VP60 主要的抗原決定區(qū)分別在其兩端，而中間區(qū)域的氨基酸序列對(duì)抗原性影響不大。

因此，本實(shí)驗(yàn)將RHDV 衣殼蛋白截短，將羧基端和氨基端的抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)和通用Th 細(xì)胞表位融合，該構(gòu)建方式不僅有利于提高抗原的表達(dá)量，還增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答。該融合蛋白的表達(dá)，為研究RHDV 新型基因工程亞單位疫苗提供參考。

[1]楊龍圣，薛家賓，王芳，等.兔出血癥發(fā)病概況及疫苗研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，256：144-147.

[2]Green K Y,Ando T,Balayan M S,et al.Taxonomy of the caliciviruses[J].J Infect Dis,2000,181:S322-330.

[3]Abrantes J,van der Loo W,Le Pendu J,et al.Rabbit haemorrhagic disease(RHD)and rabbit haemorrhagic disease virus(RHDV):a review[J].Vet Res,2012,43:12.

[4]Viaplana E,Plana J,Villaverde A.Antigenicity of VP60 structural protein of rabbit haemorrhagic disease virus[J].Arch Virol,1997,142:1843-1848.

[5]Martinez-Torrecuadrada J L,Cortes E,Vela C,et al.Antigenic structure of the capsid protein of rabbit haemorrhagic disease virus[J].J Gen Virol,1998,79(Pt 8):1901-1909.

[6]Liu Guang-qing,Ni Zheng.Rescued virus from infectious cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus is adapted to RK13 cells line[J].Chinese Science Bulletin,2006,51:1698-1702.

[7]嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤.中國(guó)株兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其免疫原性鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，5：447-449.

[8]王永山，陸承平，周宗安，等.原核表達(dá)的兔出血癥病毒衣殼蛋白對(duì)兔的免疫保護(hù)效果[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(11)：1677-1681.

[9]Laurent S,Vautherot J F,Madelaine M F,et al.Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protection[J].J Virol,1994,68:6794-6798.

[10]Nagesha H S,Wang L F,Hyatt A D,et al.Self-assembly,antigenicity,and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus(Czechoslovakian strain V-351)capsid protein expressed in baculovirus[J].Arch Virol,1995,140:1095-1108.

[11]Boga J A,Martin Alonso J M,Casais R,et al.A single dose immunization with rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection[J].J Gen Virol,1997,78(Pt 9):2315-2318.