任澎 張冰 馬麗 劉永國 莫紅梅 李秀

.臨床研究.

急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和P選擇素水平的變化

任澎 張冰 馬麗 劉永國 莫紅梅 李秀

目的 探討急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者血小板聚集功能及抗血小板治療對(duì)其影響。方法 入選ACS患者40例,分為不穩(wěn)定型心絞痛組(26例)和急性心肌梗死組(14例),采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ACS患者應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療前后血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa (PAC-1)和P選擇素(CD62P)水平的變化,并與疑診冠心病但冠狀動(dòng)脈造影檢查正常的對(duì)照組(30例)進(jìn)行比較。結(jié)果 治療前,不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者PAC-1、CD62P的表達(dá)率(%)均高于對(duì)照組(PAC-1：62.47±3.91和67.91±10.42比32.46±8.93；CD62P：16.73±3.74和18.53± 5.62比7.67±2.21,均為P＜0.05),經(jīng)雙重抗血小板治療5 d后,兩組PAC-1、CD62P的表達(dá)率(%)較治療前均明顯降低(PAC-1：43.62±9.67比62.47±3.91,46.55±4.86比67.91±10.42,均為P＜0.05；CD62P：12.38±3.29比16.73±3.74,13.39±3.41比18.53±5.62,均為P＜0.05),但仍高于對(duì)照組(均為P＜0.05)。結(jié)論 ACS患者應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷雙重抗血小板治療,可有效抑制血小板活化。

急性冠狀動(dòng)脈綜合征； 流式細(xì)胞術(shù)； P選擇素； 血小板膜糖蛋白類

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)主要是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的基礎(chǔ)上血栓形成,導(dǎo)致完全或不完全堵塞冠狀動(dòng)脈而引起的一組臨床綜合征。血小板黏附、活化和聚集在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展和心血管事件的發(fā)生中起著關(guān)鍵性作用［1］。在臨床治療上,抗血小板治療是ACS治療中最重要措施之一。血小板膜表面及其細(xì)胞器存在多種糖蛋白。血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa (PAC-1)是血小板膜含量最多的糖蛋白,在血小板的黏附、聚集及釋放反應(yīng)中起重要作用。與纖維蛋白原等結(jié)合是血小板聚集過程中的最后共同途徑,因此,檢測(cè)血小板膜表面PAC-1的表達(dá)可直接反映血小板活化聚集狀態(tài)。P選擇素(CD62P)是存在于靜止血小板顆粒膜上的一種蛋白質(zhì),活化血小板的顆粒迅速與血小板膜融合釋放,使CD62P在血小板表面重新分布,因而,CD62P在血小板膜表面的表達(dá)也是血小板活化的特異性標(biāo)志物。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ACS患者PAC-1和CD62P水平,以及應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療后的變化。

1 對(duì)象和方法

1.1 一般資料

入選2009年3月至2011年12月我院心內(nèi)科住院并行冠狀動(dòng)脈造影的患者70例,年齡38～71歲。其中ACS組患者40例,包括不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris,UAP)患者26例,其中男性15例,女性11例,年齡45～71歲,平均(39.2± 6.3)歲；急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者14例,其中男性9例,女性5例,年齡38～67歲,平均(57.4±9.1)歲。對(duì)照組30例,年齡39～70歲,平均(54.6±8.2)歲,兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)ACS組患者符合《中國冠心病診斷與治療指南》UAP或ACS診斷標(biāo)準(zhǔn),且冠狀動(dòng)脈造影提示至少一支冠狀動(dòng)脈血管病變狹窄程度≥50%；(2)對(duì)照組為疑診冠心病但冠狀動(dòng)脈造影檢查正常者；(3)所有入選者在試驗(yàn)前均未應(yīng)用阿司匹林、氯吡格雷等影響血小板功能的藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)阿司匹林過敏者；(2)已接受阿司匹林和(或)GPⅡb/Ⅲa抑制劑治療者；(3)有嚴(yán)重的肝腎功能異?；蚱渌鞴俟δ懿蝗?；(4)有明確的病毒、細(xì)菌感染,急慢性炎癥性疾??；系統(tǒng)性炎癥性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)；出血性疾病者；(5)肌病/肌病進(jìn)展期,腫瘤,合并栓塞性疾病或周圍血管性疾病者。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：FACS Calibur流式細(xì)胞儀,激光光源為15 mW的氬離子激光；一次性12×75 mm Falcon管,美國BD公司。主要試劑：(1)PAC-1,為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體；(2) CD62P-PE,為藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD62P單抗；(3) CD61 PerCP,為多甲藻黃素葉綠素蛋白標(biāo)記的活化CD61單抗；(4)Mouse γ1 Isotype control PE,為CD62P的同型對(duì)照。以上試劑均購自美國BD公司,2～8℃保存；(5)四肽RGDS(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-絲氨酸四肽,ARG-GLY-ASP-SER),PAC-1阻斷劑,用以PAC-1的陰性質(zhì)控,購自美國SIGMAAIDRICH公司。

1.3 檢測(cè)方法

所有入選者均在入院后應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療前,于清晨空腹相同時(shí)間采用采血針及BD VacutainerTM真空采血管采集肘正中靜脈血5 ml。ACS組于應(yīng)用阿司匹林和氯吡格雷抗血小板治療5 d后在清晨空腹相同時(shí)間再次抽取靜脈血進(jìn)行檢測(cè)。抽取血液標(biāo)本時(shí)不扎止血帶,棄去前2 ml可能混有組織液的血液,輕輕混勻,避免采血管劇烈搖動(dòng),以減少采血過程中人工激活。采血后20 min內(nèi)完成標(biāo)本的標(biāo)記及固定步驟。將流式管標(biāo)號(hào)以區(qū)分對(duì)照管和試驗(yàn)管。用移液器向各對(duì)照管中加入PAC-1、CD61 PerCP、Mouseγ1 Isotype control PE各10 μl,RGDS 5 μl,試驗(yàn)管中加入PAC-1、CD62PPE、CD61 PerCP各10 μl,混勻后向上述試管中各加入血液標(biāo)本5 μl,輕輕混勻,避光室溫孵育15 min。各管中加入預(yù)冷的固定液(1%多聚甲醛,2～8℃) 1 ml并輕輕混勻。放置于冰箱2～8℃避光30 min。標(biāo)本制備完成后24 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前PAC-1、CD62P水平

UAP組患者抗血小板治療前PAC-1和CD62P的表達(dá)率分別為62.47%±3.91%和16.73%± 3.74%；AMI組PAC-1和CD62P的表達(dá)率分別為67.91%±10.42%和18.53%±5.62%；對(duì)照組PAC-1和CD62P的表達(dá)率分別為32.46%±8.93%和7.67%±2.21%。應(yīng)用方差分析比較,對(duì)照組、UAP組和AMI組之間PAC-1和CD62P的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。進(jìn)行兩兩比較, UAP組和AMI組均明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05),而UAP組與AMI組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05),見表1。

表1 各組治療前后PAC-1和CD62P表達(dá)率變化(%)

2.2 ACS組治療后PAC-1、CD62P水平變化

UAP組患者抗血小板治療后PAC-1和CD62P的表達(dá)率分別為43.62%±9.67%和12.38%± 3.29%；AMI組PAC-1和CD62P的表達(dá)率分別為46.55%±4.86%和13.39%±3.41%,較治療前明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05),但仍高于對(duì)照組(均為P＜0.05)。UAP組與AMI組之間差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05),見表1。

3 討論

大量研究證實(shí),血小板活化在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展、UAP及AMI冠狀動(dòng)脈血栓形成過程中起著至關(guān)重要的作用［2］。檢測(cè)體內(nèi)有無血小板活化及其程度對(duì)于冠心病的診斷具有重要意義?；罨“孱w粒膜蛋白在質(zhì)膜上的高水平表達(dá)可引起GPⅡb/Ⅲa及CD62P的顯著性改變［3］。血小板GPⅡb/Ⅲa受體與纖維蛋白原等相結(jié)合是各種血小板激動(dòng)劑導(dǎo)致血小板凝集過程中的最后共同途徑,因此,檢測(cè)血小板膜表面GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)可直接反映血小板活化聚集狀態(tài)［4］。CD62P是存在于靜止血小板α顆粒膜上的一種蛋白質(zhì),可以介導(dǎo)血小板黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞,激活中性粒細(xì)胞,釋放血管活性物質(zhì)和氧代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致血管收縮,阻塞小血管啟動(dòng)血栓形成過程,在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。當(dāng)血小板被活化時(shí),血小板胞質(zhì)內(nèi)處于靜止期的CD62P隨著活化血小板的“脫顆?！卑l(fā)生易位,與質(zhì)膜相融合,在血小板膜表面大量表達(dá),成為識(shí)別活化血小板的特異性標(biāo)志物［5］。參與血小板的第二相聚集,在啟動(dòng)和擴(kuò)大血栓形成中具有重要意義。

ACS的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂后,血管內(nèi)皮下膠原組織暴露,隨之發(fā)生血小板黏附聚集和血栓形成,造成冠狀動(dòng)脈阻塞。血小板的功能在此過程中起著關(guān)鍵的作用。研究顯示,心血管疾病患者抗血小板治療可以有效減少動(dòng)脈粥樣硬化事件的發(fā)生,對(duì)于進(jìn)行了冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建術(shù)的患者也可以減低術(shù)后冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生率［6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,抗血小板治療可以減輕AMI引起的缺血及再灌注損傷［7］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定UAP和AMI患者入院時(shí)及經(jīng)雙重抗血小板治療5 d后PAC-1和CD62P的表達(dá)率,并與對(duì)照組相比較,發(fā)現(xiàn)ACS患者(包括UAP和AMI)聯(lián)合抗血小板治療前后血小板PAC-1和CD62P的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(均為P＜0.05),表明AMI患者有明顯的血小板活化,提示ACS患者體內(nèi)血小板的黏附、聚集、釋放反應(yīng)均增高,是血栓形成的高?；颊?。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道,冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變程度與PAC-1陽性表達(dá)率呈正相關(guān),心肌梗死患者血小板活化率明顯增高［8］。阿司匹林和氯吡格雷等抗血小板藥物是目前心肌梗死等冠狀動(dòng)脈疾病關(guān)鍵的預(yù)防和治療藥物［9］。研究發(fā)現(xiàn),UAP組及AMI組抗血小板治療后血小板活化程度較治療前明顯下降,但仍高于對(duì)照組,表明阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合抗血小板治療可有效降低血小板活化狀態(tài),但不能完全消除致血小板活化因素,其機(jī)制是由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,使血小板活化因素?zé)o法逆轉(zhuǎn),血小板長期處于活化狀態(tài),因而需要長期抗血小板治療預(yù)防血栓形成［10］。本研究還發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的血循環(huán)中,PAC-1和CD62P有低水平的表達(dá),與蔡俊明等［11］的研究一致,這可能是機(jī)體維持凝血-抗凝系統(tǒng)功能平衡的生理現(xiàn)象。

本研究表明,PAC-1和CD62P的表達(dá)率能反映血小板聚集功能,ACS患者體內(nèi)血小板處于高度活化狀態(tài),應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷雙重抗血小板治療可有效抑制血小板活化,但不能完全消除致血小板活化因素,需要長期抗血小板治療預(yù)防血栓形成。

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Changes of platelet glycoproteinⅡb/Ⅲa and P-selectin in patients with acute coronary syndrome

Ren Peng1,Zhang Bing2,Ma Li1,Liu Yongguo1,Mo Hongmei3,Li Xiu3.
1 Department of Cardiology,the Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital,Urumchi 830001,China；2 Department of Clinical Laboratory；3 Department of Emergency,the Affiliated Hospital of Binzhou Medical School

Objective To investigate the changes of platelet glycoproteinⅡb/Ⅲa(PAC-1)and P-selectin(CD62P)in patients with acute coronary syndrome(ACS)and the influence of antiplatelet therapy. Methods Forty ACS patients were divided into UAP group(n=26)or AMI group(n=14)and 30 normal subjects as control group.Platelet membrane PAC-1 and CD62P were measured by flow cytometry in ACS patients before and after antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel,and then compared with normal control group.Results The expression levels of PAC-1 and CD62P in patients with ACS were significantly higher than those in controls(62.47±3.91 vs.32.46±8.93；67.91±10.42 vs.32.46±8.93；16.73± 3.74 vs.7.67±2.21；18.53±5.62 vs.7.67±2.21；all P＜0.05).PAC-1 and CD62P expression levels were significantly decreased after 5 days of antiplatelet therapy(43.62±9.67 vs.62.47±3.91；46.55± 4.86 vs.67.91±10.42；12.38±3.29 vs.16.73±3.74；13.39±3.41 vs.18.53±5.62,all P＜0.05), but still higher than controls(all P＜0.05).Conclusions Aspirin and clopidogrel dual antiplatelet therapy can effectively inhibit platelet activation in patients with ACS.

Acute coronary syndrome； Flow cytometry； P-Selectin； Platelet membrane glycoproteins

Ren Peng,Email：renpengcvd@163.com

2013-09-28)

(本文編輯：譚瀟)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.03.005

830001烏魯木齊,新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科(任澎、馬麗、劉永國),檢驗(yàn)科(莫紅梅、李秀)；濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科(張冰)

任澎,電子信箱：renpengcvd@163.com