劉家麒，游柳平綜述 黃躍南審校

綜 述

亞穩(wěn)外延等位基因與結(jié)直腸癌變機(jī)制相關(guān)性研究進(jìn)展

劉家麒，游柳平綜述 黃躍南審校

亞穩(wěn)外延等位基因；結(jié)直腸癌；無創(chuàng)檢查；DNA甲基化；表觀遺傳標(biāo)志

亞穩(wěn)外延等位基因(MEs)是哺乳動物表觀等位基因組位點，可以被一種可變、可逆的方式修飾，使遺傳上相同細(xì)胞出現(xiàn)不同的表型分布[1，2]。多項研究結(jié)果顯示，在胃癌、乳腺癌、大腸癌、腎母細(xì)胞瘤中一些MEs基因發(fā)生DNA甲基化，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3～13]。結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是最常見的惡性腫瘤，近年發(fā)病率和病死率明顯上升。大量證據(jù)表明，無創(chuàng)檢查可以明顯提高CRC的早期診斷率，已得到公眾的認(rèn)可。迄今為止，DNA甲基化檢測是一種無創(chuàng)檢查CRC的理想方案。本文就MEs相關(guān)CRC癌變機(jī)制的最新進(jìn)展綜述如下。

1 結(jié)直腸癌的早期檢測與預(yù)后

結(jié)直腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)疾病發(fā)病和死亡的一個主要原因。CRC在男性是第3位最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤居第2位，2008年有超過120萬個新發(fā)病例，估計有608 700人死亡[14]。近幾十年來,隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高,在包括中國、日本、韓國和新加坡在內(nèi)的一些亞洲國家和地區(qū)，CRC的發(fā)病率增加了2～4倍，患病率也呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，這與飲食習(xí)慣趨向于高蛋白質(zhì)、高脂肪、低纖維素變化有很大關(guān)系。被診斷為CRC的患者往往存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(IV期)且無法治愈，大約40%的CRC患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移。顯然，局部癌癥(I/II期)及早發(fā)現(xiàn)更有利于根治性治療，提供更好的預(yù)后。

現(xiàn)有的CRC篩查技術(shù)包括大便隱血試驗、雙對比鋇灌腸、內(nèi)窺鏡檢查、直腸指診以及血清癌胚抗原(CEA)的檢驗?，F(xiàn)有的篩選方式使病死率僅有下降，但沒有達(dá)到很高的公眾參與。例如結(jié)腸鏡檢查是侵入性的策略，而大便隱血測試的用途有限，因為需要進(jìn)行反復(fù)測量并受到膳食成分的干擾；在早期階段CEA缺乏足夠的靈敏度，容易受到憩室炎、胃炎、糖尿病等良性疾病的影響。在過去的10年，腫瘤來源的異常DNA可以在癌癥患者的血漿或血清中檢測發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化(DNA methylation)用于早期癌癥的檢測是一個很有前途的工具。幾項研究證明來源于癌癥患者血液中實體腫瘤的自由DNA的存在[3～13]，提高了在被檢者體內(nèi)檢測出癌癥特異性分子的可能性。生物標(biāo)志物的使用，特別是表觀遺傳生物標(biāo)志物血清、尿液、糞便，有望縮小侵襲而可靠的測試和非侵入性但不可靠研究之間的差距。無創(chuàng)檢查診斷CRC和癌前病變的DNA甲基化的生物標(biāo)志物已被廣泛研究，無創(chuàng)更利于患者接受，同時提高CRC篩查率。

2 MEs的生物學(xué)功能

表觀等位基因(epiallele)是一種廣義生物等位基因，是在同一基因座位中，DNA發(fā)生不同程度的甲基化所形成的等位基因。由于環(huán)境對表觀遺傳標(biāo)記的影響，有3個基因組目標(biāo)可能對基因表達(dá)有易感性：一些管家基因的啟動子區(qū)域、與MEs鄰近的轉(zhuǎn)座子元件和印記基因的調(diào)控元件。表觀遺傳學(xué)改變，包括DNA甲基化和組蛋白修飾，可以獨立地影響基因表達(dá)的遺傳密碼。表觀基因在妊娠期、新生兒發(fā)育期、青春期和老年期都容易發(fā)生異常，但在胚胎發(fā)育過程中最容易受到環(huán)境因素的影響。因為在早期發(fā)育過程中DNA合成的速率很高，而且人體正常組織發(fā)育所需的復(fù)雜DNA甲基化的圖案和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)也是這個時期建立的。MEs是Rakyan在2002年發(fā)現(xiàn)的哺乳動物基因組位點，這個位點可以被一種可變、可逆的方式修飾，使遺傳上相同細(xì)胞出現(xiàn)不同的表型分布[1，2]。等位基因的表達(dá)常常與轉(zhuǎn)座子的表觀狀態(tài)有關(guān)，大多數(shù)的轉(zhuǎn)座子元件是沉默的，但是轉(zhuǎn)座子元件子集的表觀遺傳狀態(tài)是亞穩(wěn)的，并且以一個隨機(jī)地方式從低甲基化到高甲基化變化。在實驗室對鼠的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前環(huán)境可以影響產(chǎn)后表型，這為早期環(huán)境影響哺乳動物的表觀基因組的修飾并且關(guān)聯(lián)到不同疾病表型提供了根據(jù)[15，16]。環(huán)境表觀基因組學(xué)中MEs是已知的對環(huán)境敏感的表觀遺傳標(biāo)記，這種可變的表觀遺傳狀態(tài)影響鄰居基因的表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是發(fā)生癌變早期階段頻繁出現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)變化，可以作為癌癥存在的一個指標(biāo)[7，17]。此外，啟動子區(qū)域內(nèi)異常的DNA甲基化基因可能會導(dǎo)致染色質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)[18]。抑癌基因的啟動子CpG島甲基化是一種常見的人類癌癥的標(biāo)志[19，20]，有助于癌癥的發(fā)生和發(fā)展。一般來說，腫瘤抑制基因的表達(dá)減少是由于等位基因的喪失或啟動子區(qū)域的超甲基化。一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，一些DNA甲基化的基因的變化已被聯(lián)系到各種形式的人類疾病，如哮喘和急性髓系白血病、胃癌、乳腺癌、大腸癌、腎母細(xì)胞瘤等，這提示MEs在腫瘤潛在的致病作用，并強調(diào)MEs可能是這些惡性腫瘤的發(fā)展起源。其中與CRC關(guān)系最密切的基因有EBF3、KCNK15、TCERG1L、FBN2、NDRG4等[16，21，22]。

2.1 EBF3 早期B細(xì)胞因子(early B-cell factor，EBF)為核轉(zhuǎn)錄因子,又稱COE或O/E,家族成員由EBF1、EBF2、EBF3、EBF4組成，均通過其非典型的鋅指結(jié)構(gòu)(H-X3-C-X2-C-X5-C)與含有5c-CCCNNGGG-3c的DNA序列結(jié)合，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、B細(xì)胞成熟、骨質(zhì)代謝平衡、脂肪細(xì)胞分化成熟及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。EBF3在1997年由Wang等[23]利用序列同源性篩選的方法在鼠胚胎cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，人EBF3由551個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為60 kD，mRNA全長為4361bp，基因定位于染色體10q26.3。EBF3 mRNA廣泛表達(dá)于心臟、胎盤、肝臟、骨骼肌等組織，在細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞凋亡中具有關(guān)鍵作用。EBF3作為一種抑癌基因，在不同的腫瘤細(xì)胞具有廣泛的抑制腫瘤功能[24]。在腦腫瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌和骨腫瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤組織中，EBF3呈甲基化或者缺失[25～28]。EBF3在正常的細(xì)胞系表達(dá),但在腦腫瘤細(xì)胞系中沉默，其表達(dá)可能被5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)和曲古抑菌素A(trichostatin A)重新激活[28]。研究結(jié)果表明，EBF3的表觀遺傳沉默是人類癌癥的一個普遍現(xiàn)象，EBF3甲基化可以做為腫瘤的表觀遺傳標(biāo)志物，并且可以用抗癌藥物治療后逆轉(zhuǎn)，可能為腫瘤治療提供一個新思路。

2.2 KCNK15 KCNK通道是一類新型的鉀離子通道,與電壓依賴性鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道均有所不同,它具有4個跨膜片斷(tansmembrane segment，TM)和2個膜孔區(qū)(pore domain，P)。KCNK通道最初被稱為K2P通道(two-pore-domain potassium channels)，后被統(tǒng)一命名為KCNK通道。該家族共有17個亞族，系統(tǒng)命名依次為KCNK1～KCNK17。這種通道最初發(fā)現(xiàn)于酵母細(xì)胞中，廣泛分布于興奮和非興奮組織中，在心肌細(xì)胞上主要為TWIK、TASK和TREK。KCNK15(又稱為KT3.3、TASK5、TASK-5、K2p15.1)，位于染色體20q13.12區(qū)域，KCNK15島連接EST和外顯子BF195580，主要表達(dá)在腎上腺和胰腺，可能對這些器官中激素的分泌扮演重要的角色，在心臟、骨骼肌、睪丸、甲狀腺、唾液腺也少量表達(dá)。近30年研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中K+通道調(diào)控細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、腫瘤血管形成，侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[29]。在腫瘤微環(huán)境中K+通道也可以調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。用亞硫酸氫鈉焦磷酸測序檢測血液樣本雙向啟動子甲基化水平，在10個細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)KCNK15甲基化,包括結(jié)腸癌、白血病、膀胱癌，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中呈高度甲基化[30]。而通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DAC)治療后，雙向啟動子的甲基化有不同程度降低，表明啟動子甲基化可以被藥物逆轉(zhuǎn)。大約25%的癌癥高甲基化啟動子相關(guān)的CpG島是雙向的，暗示KCNK15的雙向啟動子甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能是一個重要途徑。

2.3 TCERG1L 轉(zhuǎn)錄延伸器1系(transcription elongation regulator 1-like，TCERG1L)的基因位于10號染色體上。TCERG1L可能與TCERG1(轉(zhuǎn)錄延伸器1)有相似的生物學(xué)作用，TCERG1位于人類染色體5q32，TCERG1也被稱為TAF2S；TATA盒結(jié)合蛋白相關(guān)因子2S，CA150，轉(zhuǎn)錄因子CA150)，最初被確定為通過相對應(yīng)答HeLa細(xì)胞核片段來調(diào)節(jié)人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)轉(zhuǎn)錄延長[31]。TCERG1由多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，最顯著的是在N-末端有3個WW結(jié)構(gòu)域，在C-末端有6個重復(fù)的FF結(jié)構(gòu)域。TCIRG1與血漿脂聯(lián)素關(guān)系密切[32]，血漿脂聯(lián)素是肥胖病、炎性反應(yīng)、胰島素抵抗(IR)和糖尿病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在基因芯片技術(shù)研究中顯示頻發(fā)的腫瘤特異性甲基化，TCERG1L最近已被確定為在結(jié)腸癌中的一個低頻的突變基因[33，34]。Kim等[35]研究發(fā)現(xiàn)TCERG1L可以增加炎性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)患者發(fā)展為CRC的風(fēng)險。Yi等[36]通過突變基因的DNA甲基化分析證實TCERG1L在CRC甲基化頻率>90%。在大腸癌中TCERG1L甲基化和表達(dá)下調(diào)是腫瘤特異性的方式，可能是CRC前病變和癌變的無創(chuàng)性檢測的一個重要的生物標(biāo)志物[37]。

2.4 原纖維蛋白-2(FBN2) 原纖蛋白(fibrillin，F(xiàn)BN)是具有高度同源性的氨基酸序列保守的多結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，主要結(jié)構(gòu)部件糖蛋白是細(xì)胞外與鈣離子結(jié)合的平均直徑為10 nm微纖維，F(xiàn)BN有2個成員FBN1和FBN2。FBN2是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由47個類EGF結(jié)構(gòu)域組成,其中43個有一致的鈣結(jié)合序列，被含有固定模塊的8個半胱氨酸阻斷，固定模板是在隱藏的TGF-β1結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)的，模板由一個獨特的C端、N末端和一個富含甘氨酸的小結(jié)構(gòu)域組成。它與彈性纖維在若干組織相關(guān)聯(lián)，被認(rèn)為是作為一種αvβ3整合素配體，后者是一個已知的成形素。FBN2首先被發(fā)現(xiàn)表達(dá)在間質(zhì)組織及上皮間質(zhì)界面。FBN2優(yōu)先定位于彈性組織，如彈性軟骨和主動脈內(nèi)膜層。研究表明FBN2在肺發(fā)育起著關(guān)鍵的作用，在肺癌發(fā)展中扮演著重要角色[38]。使用高通量的基因芯片分析的方法確定在胰腺癌細(xì)胞株FBN2啟動子甲基化[39]。FBN2被證實原發(fā)性乳腺癌組織[40]、食管鱗狀細(xì)胞癌[41]、腎癌組織中FBN2啟動子區(qū)域頻繁甲基化，F(xiàn)BN2沉默可促進(jìn)腫瘤發(fā)生[42]。Beggs等[43]用基因集富集分析(GSEA)比較癌與正常組織發(fā)現(xiàn)369組基因的高甲基化基因，F(xiàn)BN2甲基化的程度最高。Yagi等[44]證實FBN2 DNA在正常組織中度甲基化，F(xiàn)BN2在結(jié)腸癌組織中沉默，與KRAS基因突變(+)與較差的預(yù)后相關(guān)。Yi等[36]在結(jié)腸癌細(xì)胞系通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測啟動子區(qū)域FBN2完全甲基化，并觀察到88%的管狀腺瘤和91%的絨毛狀腺瘤組織中FBN2甲基化，F(xiàn)BN2基因可能是CRC早期檢測的生物標(biāo)志物。

2.5 NDRG4 Myc基因是一種原癌基因，通過對其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與許多生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)病機(jī)制等[45]。其下游調(diào)控基因家族(N-Myc Downstream-Regulated Gene，NDRG)，由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成，NDRG在最近幾年被確定為一類新的Myc抑制基因。NDRG家族成員已被證明是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，并可以用作許多疾病和癌癥的生物標(biāo)志物[46]。NDRG1基因在大腸癌中高表達(dá)可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[47]。NDRG2已被認(rèn)為是一個候選抑癌基因[48]。NDRG4基因位于染色體16q21-q22.3，長度26個堿基，并包含17個外顯子，其中包括3個互補的DNA(cDNA)的異構(gòu)體：NDRG4-B、NDRG4-B var和NDRG4-H。NDRG4主要表達(dá)在出生后早期的大腦、脊髓中的神經(jīng)元和心臟，參與細(xì)胞分化和神經(jīng)突形成過程。NDRG3和NDRG4被認(rèn)為是抑癌基因，在生物過程和發(fā)病機(jī)制有重要作用[22]。NDRG4在細(xì)胞分化和軸突形成中扮演重要角色，是細(xì)胞周期進(jìn)程、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和癌癥干細(xì)胞濃縮細(xì)胞生存所必需的，是腦腫瘤獨立預(yù)后因素[49，50]，NDRG4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、入侵和遷移[51]。在糞便中提取的NDRG4 DNA標(biāo)志物的檢測結(jié)果表明，糞便DNA檢測在結(jié)直腸腫瘤、炎性腸病及胰腺癌非侵入性檢測的可行性[4，52～55]，而且糞便DNA測試比血漿DNA檢測更準(zhǔn)確[11]。Melotte等[56]通過對糞便脫落的DNA檢測，證實NDRG4是無創(chuàng)檢測糞便樣本中大腸癌的潛在生物標(biāo)志物。

3 MEs與腫瘤的關(guān)系及研究進(jìn)展

CRC的發(fā)生由遺傳和環(huán)境等諸多因素相互作用所致，是一個涉及多基因、多階段的復(fù)雜過程，主要發(fā)生途徑為：(1)染色體不穩(wěn)定(chromosome instability，CIN )途徑；(2)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)途徑；(3)CpG島甲基化表型(CPG island methylator phenotype，CIMP)途徑；(4)鋸齒狀途徑。各條途徑存在特異性基因和表觀遺傳性改變，部分CRC的發(fā)生發(fā)展涉及2條及其以上途徑[57]?！癕Es”一詞是描述在哺乳動物中等位基因的差異表達(dá)與表觀遺傳差異相關(guān)，而不是與遺傳異質(zhì)性相關(guān)。Agouti viable yellow(AVY)小鼠是這種等位基因中一個顯著的例子，在人類中已經(jīng)觀察到了相似的表現(xiàn)位點[1]。在AVY小鼠中，母體微量營養(yǎng)素可以在群體水平上改變DNA甲基化分布和相應(yīng)的毛皮表型，暗示著MEs存在于相同的人類疾病的環(huán)境起源。進(jìn)一步研究證明營養(yǎng)可以改變個體內(nèi)在變異，但是個體內(nèi)在的系統(tǒng)DNA甲基化在原腸胚形成之前出現(xiàn)，在其他的哺乳MEs中也出現(xiàn)相似的行為。最近在岡比亞兒童中PBL DNA的檢測支持了人類MEs的存在[15]。在這個地理區(qū)域，在遺傳平衡群體中一個連續(xù)的有前景的研究揭示，在嬰兒的DNA 甲基化中一些基因組位點被修飾，作為母性微量營養(yǎng)素補充的一個結(jié)果[58]。相關(guān)MEs定義基因表達(dá)篩查了35個基因:包括2個或更多的CpG位點，長度10 kb的基因組。這些基因的DNA甲基化的變化已經(jīng)與各種形式的人類疾病有關(guān)，如哮喘、急性髓系白血病(ALOX12)、胃癌(EBF3)、乳腺癌(NAV1)、大腸癌(KCNK15，TCERG1L)、腎母細(xì)胞瘤(PCDHAs)、帕金森病(CYP2E1)[59]、躁郁癥(HCG9)[60]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(MGMT)[61]，提示MEs在腫瘤的潛在致病作用，并強調(diào)成為這些惡性腫瘤可能的發(fā)展起源。有研究證實DNA甲基化為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)[58，59]。DNA甲基化可能使基因沉默化，進(jìn)而使其失去功能。DNA甲基化在胚胎發(fā)育期間是必需的，在體細(xì)胞DNA甲基化的方式通常是高保真的傳給子細(xì)胞。異常的DNA甲基化模式與大量人類惡性腫瘤有關(guān)，抑癌基因的啟動子CpG島甲基化已作為一種常見的人類癌癥的標(biāo)志[20，44]。SRBC基因DNA甲基化已作為CRC對奧沙利鉑耐藥的一個敏感性標(biāo)志[62]。隨著液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)的廣泛應(yīng)用，在不久的未來，DNA甲基化檢測可能在大規(guī)模人群實現(xiàn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，腫瘤形成過程中涉及多種基因，單獨一種基因的多態(tài)不足以致癌，多種基因功能的積累才能引起調(diào)控細(xì)胞生長和增殖能力的改變，使個體對腫瘤的易感性產(chǎn)生差異。目前，雖然已有部分針對MEs及其相關(guān)基因的多態(tài)位點和惡性腫瘤關(guān)系的研究，但停留于實驗室研究階段，缺乏人群研究的佐證，研究樣本量不大。本研究只能提供流行病學(xué)線索并不能揭示其作用方式?？赡艿臋C(jī)制是由于MEs的變異導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的變化，從而對蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。因此，MEs通路之間存在復(fù)雜的相互作用，需要更深入地研究分析其生物學(xué)功能，與腫瘤易感性的關(guān)系需要進(jìn)一步驗證。

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150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外十科

黃躍南，E-mail:dr-huangyuenan@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.05.036

2013-11-23)