蔣書恒,張志剛,馬銘澤,覃文新1,(綜述),李 軍(審校)
(1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院,上海 200240; 2.上海市腫瘤研究所癌基因與相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200240)
胰腺癌主要病理類型為導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),約占95%,是一種惡性程度極高的腫瘤,5年總體生存率低于4%[1]。大多數(shù)患者在確診時(shí)疾病已進(jìn)入晚期階段,失去手術(shù)機(jī)會(huì),加上胰腺癌特殊的組織病理特征,如大量結(jié)締組織增生、血管豐度低,治療藥物很難進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮藥效,導(dǎo)致患者預(yù)后極差[2]。胰腺PDAC存在三種癌前病變類型,分別是起源于小葉內(nèi)導(dǎo)管的胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)、出現(xiàn)在主胰管或其主要分支的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)以及產(chǎn)生黏蛋白的黏液性囊性瘤(mucinous cystic neoplasm,MCN)[3-4]。PanIN是目前研究最為透徹的癌前病變,也是胰腺癌的典型癌前病變?;诓坏湫驮錾潭?,PanIN病變可分為PanIN-1A、PanIN-1B、PanIN-2、PanIN-3或原位癌四級(jí)。PanIN病變經(jīng)常伴有泡心細(xì)胞萎縮和腺泡導(dǎo)管上皮化生,這些組織學(xué)病變?cè)诨蛩缴洗蠖細(xì)w因于癌基因KRAS的突變和抑癌基因,如TP53、SMAD4的失活[5-6]。胰腺癌典型的突變是KRAS基因12位點(diǎn)密碼子的突變激活,即KrasG12D,見(jiàn)于多達(dá)74%的低級(jí)別PanIN病變,發(fā)展到浸潤(rùn)癌狀態(tài)時(shí)突變率將超過(guò)90%[7]。最常見(jiàn)的突變抑癌基因是CDKN2A,30%~70% PanIN病變?cè)摶虬l(fā)生失活、缺失或表觀遺傳沉默,進(jìn)展期則高達(dá)95%[8]。在PanIN病變進(jìn)展至PDAC過(guò)程中,同時(shí)可伴有其他抑癌基因(如TP53、SMAD4)的突變以及大量信號(hào)途徑分子(如Stat3[9]、Src[10])的活化。IPMN和MCN病變中也伴有KRAS、GNAS及RNF43等基因的大量突變,其中KRAS、GNAS突變率超過(guò)95%,MCN除了KRAS、RNF43外還包括TP53等抑癌基因的失活[11-12]。
現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因小鼠模型充分模擬了胰腺癌的這些癌前病變特點(diǎn)以及侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型大都基于KRAS突變,但由于KRAS突變難以誘發(fā)胰腺癌發(fā)展到侵襲性階段,因此結(jié)合抑癌基因缺失或突變的復(fù)合小鼠模型已被用于模擬更加符合臨床實(shí)際的侵襲性和轉(zhuǎn)移性PDAC,如結(jié)合SMAD4基因缺失的Pdx1-Cre、KrasG12D、Smad4lox/lox小鼠模型。同時(shí),絕大多數(shù)胰腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型都是建立在Cre-LoxP系統(tǒng)上,即利用Cre-loxP技術(shù),先通過(guò)與打靶載體的同源重組,在基因組中引入loxP位點(diǎn),再通過(guò)Cre重組酶介導(dǎo)的DNA重組,在特定組織或特定時(shí)相,實(shí)現(xiàn)靶基因的修飾或改變[13]。近年來(lái)建立了多種胰腺癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,以下重點(diǎn)介紹幾種常用轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
胰十二指腸同源盒基因1(pancreatic duodenal homeobox 1,Pdx-1)和胰腺特異轉(zhuǎn)錄因子(pancreas specific transcription factor 1a,Ptf1a/P48)作為胰腺發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,被廣泛應(yīng)用于研究胰腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠模型[14-15]。Pdx-1、p48/Ptf1a的表達(dá)分別開(kāi)始于小鼠胚胎第8.5日和第9.5日,它們的表達(dá)是胰腺發(fā)生所必須的。
Hingorani等[16]開(kāi)發(fā)了一種Cre重組酶啟動(dòng)KrasG12D表達(dá)的小鼠模型,這些小鼠與胰腺組織特異性Cre重組酶的小鼠雜交,如Pdx1-Cre或Ptf1a-Cre,產(chǎn)生Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D和Ptf1a-Cre,LSL-KrasG12D小鼠,可使KrasG12D表達(dá)發(fā)生在Cre重組酶介導(dǎo)敲除兩側(cè)loxP之間的Stop位點(diǎn)之后。
這些小鼠胰腺形成的導(dǎo)管病變與人類三個(gè)階段的PanIN極為相似。PanIN-1A病變一般在2周齡突變小鼠即可觀察到,隨著小鼠年齡增長(zhǎng),核不典型性增加,細(xì)胞極性逐漸喪失,高級(jí)別PanIN病變出現(xiàn)增多;至PanIN-2時(shí),細(xì)胞極性完全喪失,上皮芽形成,出現(xiàn)真性篩狀結(jié)構(gòu)或腔內(nèi)壞死;最后,腺泡實(shí)質(zhì)被大量基質(zhì)、膠原纖維、促纖維增生性成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞所取代,極少的小鼠可在1年內(nèi)發(fā)生PDAC侵襲或轉(zhuǎn)移,活檢發(fā)現(xiàn)胰腺增大變硬伴有纖維化,腹腔可見(jiàn)大量血性腹水,在肝臟、橫膈、胸膜表面可見(jiàn)硬性腫瘤結(jié)節(jié)。
Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D和Ptf1a-Cre,LSL-KrasG12D模型展示了PanIN的病變進(jìn)展和極少的小鼠胰腺PanIN病變可發(fā)展為侵襲性和轉(zhuǎn)移性癌,同時(shí)觀察到類似人類胰腺PDAC的病理特征和轉(zhuǎn)移灶情況,適用于研究人類疾病。但仍然存在一定缺陷,如腫瘤自發(fā)時(shí)間長(zhǎng),難以發(fā)展到侵襲或轉(zhuǎn)移狀態(tài)等。
在以上兩種模型的基礎(chǔ)上,人們結(jié)合胰腺癌中抑癌基因的缺失或突變又開(kāi)發(fā)了多種符合人類胰腺癌臨床特征的轉(zhuǎn)基因小鼠模型[17-31]。
細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)又稱INK4A,其突變失活在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中很常見(jiàn)[32]。INK4A基因所在位點(diǎn)是重疊編碼基因位點(diǎn),同時(shí)還編碼一種ARF基因,也是一種重要的抑癌基因。INK4A/ARF修飾轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究顯示,INK4A/ARF基因全部或單一缺失并不能自發(fā)胰腺癌[17]。Aguirre等[18]將INK4A/ARF缺失與Cre重組酶介導(dǎo)激活的KrasG12D相結(jié)合,產(chǎn)生了Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D,Ink4a/Arflox/lox模型。
在這個(gè)模型中,利用Pdx1-Cre重組酶介導(dǎo)INK4A/ARF基因exon2和exon3的切除以及KrasG12D的表達(dá),進(jìn)而在胰腺特異性消除p16Ink4a、p19Arf蛋白和誘導(dǎo)KrasG12D蛋白表達(dá)。3周齡的Pdx1-cre,KrasG12D,Ink4a/Arflox/lox小鼠開(kāi)始出現(xiàn)低級(jí)別PanIN病變,4周齡時(shí)高級(jí)別PanIN病變廣泛見(jiàn)于胰腺實(shí)質(zhì),5周齡時(shí)大多數(shù)小鼠可見(jiàn)多發(fā)微型腫瘤病灶。至7~11周齡時(shí),小鼠外形消瘦伴有腹水、黃疸等癥狀,活檢顯示胰腺腫瘤直徑4~20 mm,邊界不清,具有高度侵襲性,經(jīng)常累及十二指腸、胃和脾臟,但沒(méi)有肝或肺轉(zhuǎn)移。與導(dǎo)管上皮表型一致,腫瘤細(xì)胞CK19表達(dá)陽(yáng)性,腺泡和胰島標(biāo)記表達(dá)陰性,組織中可見(jiàn)間質(zhì)大量膠原沉積。小鼠生存期很短,一般不會(huì)超過(guò)11周。
總之,INK4A/ARF基因缺失結(jié)合KrasG12D突變小鼠早期即會(huì)出現(xiàn)PanIN病變,并且這些病變能夠快速進(jìn)展為高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤。
抑癌基因TP53在將近75%的人類胰腺癌中存在突變?;赑dx1-Cre,LSL-KrasG12D小鼠模型,Hingorani等[19]用同源重組和Cre-loxP方法,構(gòu)建了條件表達(dá)Trp53R172H點(diǎn)突變等位基因,通過(guò)與Pdx1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交能同時(shí)激活胰腺祖細(xì)胞KrasG12D和Trp53R172H突變的表達(dá)。
4~6周齡的Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D,LSL-Trp53R172H/+小鼠PanIN病變同在Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D小鼠中觀察到的類似,從10周齡開(kāi)始,PanIN病變負(fù)荷顯著增加并出現(xiàn)廣泛的原位癌病變。小鼠自發(fā)PDAC約2.5個(gè)月左右,可轉(zhuǎn)移至肝、肺、橫膈膜和腎上腺等處,同時(shí)存在惡病質(zhì)、血性腹水等癥狀,沒(méi)有觀察到類似人類胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物。組織學(xué)特征同在人類胰腺癌中觀察到的相似,腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK19和黏蛋白。小鼠生存期不會(huì)超過(guò)12個(gè)月,中位生存期顯著縮短,約5個(gè)月。在原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移病灶存在高度的基因組不穩(wěn)定性,研究證實(shí)其與KrasG12D和Trp53R172H的表達(dá)密切相關(guān)。
Pdx1-Cre,LSL-KrasG12D,LSL-Trp53R172H/+小鼠模型能夠完整模擬胰腺癌的臨床綜合征、病理組織學(xué)和轉(zhuǎn)移性特征,對(duì)于理解疾病發(fā)病機(jī)制,用于檢測(cè)和制訂針對(duì)性治療策略具有重要意義。
雖然SMAD4基因與胰腺細(xì)胞分化之間沒(méi)有明確的關(guān)系,但SMAD4基因缺失能顯著加快KrasG12D突變引起的腫瘤包括胰腺腫瘤的進(jìn)展。腫瘤抑制基因SMAD4編碼的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)下游的一個(gè)中心效應(yīng)分子,其突變失活在胰腺癌很常見(jiàn)[34-35]。已有不同研究小組通過(guò)在小鼠生殖細(xì)胞基因組SMAD4基因的exon8和exon9位置靶入loxP位點(diǎn),與Pdx1-Cre或Ptf1a-Cre小鼠雜交后產(chǎn)生胰腺特異性Smad4剔除小鼠[20-22]。
從第4周開(kāi)始,Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox小鼠表現(xiàn)出低級(jí)別PanIN病變及腺泡導(dǎo)管上皮化生,7~12周之間出現(xiàn)腹部腫塊,部分小鼠并發(fā)胃部腫瘤。IPMN病變見(jiàn)于大部分小鼠,組織染色Mucin1、Mucin4和Mucin5AC表達(dá)陽(yáng)性,腫瘤細(xì)胞CK19、Shh、Hes1及磷酸化Stat3染色陽(yáng)性,腺泡和胰島標(biāo)記表達(dá)陰性。小鼠中位生存期9個(gè)月左右,無(wú)病生存期在13周左右。盡管KrasG12D表達(dá)和SMAD4基因缺失小鼠表現(xiàn)出快速IPMN,但腫瘤惡性進(jìn)展緩慢,外顯率很低。Bardeesy等[20]在Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox模型基礎(chǔ)上整合INK4A基因缺失形成的Pdx1-Cre,KrasG12D,Ink4a/Arflox/lox,Smad4lox/lox小鼠模型,IPMN病變相對(duì)減少,但PDAC潛伏期大大縮短,同時(shí)外顯率也增加。
Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox小鼠模型適合研究IPMN以及TGF-β-Smad4途徑在胰腺癌形成過(guò)程的作用,如增殖、遷移、分化以及腫瘤微環(huán)境中的血管形成,同時(shí)研發(fā)針對(duì)這條途徑的抗胰腺癌新藥物等。
TGF-β信號(hào)在PDAC進(jìn)展中起重要的作用,在55%的人類PDAC存在缺失或突變[36-38]。TGF-β的Ⅱ型受體TGFBR2在部分胰腺癌中也存在突變。Ijichi等[23]將TGFBR2基因特異性敲除小鼠同KrasG12D突變小鼠雜交產(chǎn)生Ptf1a-Cre,LSL-KrasG12D,Tgfbr2lox/lox小鼠模型。
從3.5周齡開(kāi)始,Ptf1a-Cre,LSL-KrasG12D,Tgfbr2lox/lox小鼠腫瘤組織廣泛發(fā)生PanIN病變以及腺泡導(dǎo)管上皮化生。6~7周齡時(shí),腹部擴(kuò)張,透過(guò)皮膚可覺(jué)察到腫瘤存在,小鼠很快開(kāi)始消瘦,伴有血性腹水甚至黃疸等癥狀,隨后死亡,中位生存期為59 d。病理解剖顯示這些小鼠100%發(fā)生分化良好的PDAC,病變經(jīng)常伴有肝、肺轉(zhuǎn)移,十二指腸及腹膜浸潤(rùn)。腫瘤細(xì)胞CK19和黏蛋白染色陽(yáng)性,基質(zhì)波形蛋白和平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá),結(jié)締組織生長(zhǎng)因子強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),腺泡細(xì)胞和胰島標(biāo)記,淀粉酶和胰島素表達(dá)陰性。
Ptf1a-Cre,LSL-KrasG12D,Tgfbr2lox/lox小鼠模型與人類胰腺癌惡性進(jìn)展十分相似,在KrasG12D活化狀態(tài)下結(jié)合TGFBR2缺失研究TGF-β信號(hào)在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中的作用,對(duì)于全面了解胰腺癌以及開(kāi)發(fā)新療法提供了很好地平臺(tái)。
KrasG12V突變?cè)谛∈笈咛ジ杉?xì)胞中表達(dá)可誘發(fā)廣泛的PanIN病變及PDAC,但在成年小鼠中需經(jīng)歷慢性胰腺炎刺激誘發(fā),Guerra等[29]將LSL-KrasG12Vgeo小鼠與采用Tet-Off系統(tǒng)控制彈性蛋白酶啟動(dòng)子啟動(dòng)Cre重組酶表達(dá)的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,產(chǎn)生了Elastase-tTA,Tet-O-Cre,LSL-KrasG12Vgeo轉(zhuǎn)基因小鼠模型。在Elastase-tTA,Tet-O-Cre,LSL-KrasG12Vgeo小鼠的基礎(chǔ)上,Guerra等[30]又分別整合TP53及INK4A/ARF基因缺失建立了Elastase-tTA,Tet-O-Cre,LSL-KrasG12Vgeo,p53lox/lox和Elastase-tTA,Tet-O-Cre,LSL-KrasG12Vgeo,Ink4a/Arflox/lox轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
Elastase-tTA,Tet-O-Cre,LSL-KrasG12Vgeo小鼠在3個(gè)月左右可形成低至中級(jí)別PanIN病變,12個(gè)月時(shí)80%小鼠胰腺發(fā)展為高級(jí)別PanIN病變,伴有大量基質(zhì)膠原沉積及纖維增生。50%小鼠會(huì)自發(fā)胰腺癌,并侵犯周圍如十二指腸和胃等組織,伴有神經(jīng)侵襲。結(jié)合Ink4a/Arf或Trp53缺失能夠顯著促進(jìn)胰腺PanIN病變和PDAC的進(jìn)展,腫瘤可轉(zhuǎn)移至肝、橫膈膜、肺、淋巴結(jié)和脾等處,同時(shí)小鼠中位生存期也大大降低。
這一模型通過(guò)誘導(dǎo)胰腺炎結(jié)合KRAS突變研究胰腺癌,強(qiáng)調(diào)了密切監(jiān)測(cè)臨床上胰腺炎患者的胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)的重要性。
綜上可知,胰腺癌在發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中伴有大量基因的突變或缺失、失活,除以上介紹的轉(zhuǎn)基因模型外,途徑相關(guān)基因如NOTCH1[25]、NOTCH2[26]和抑癌基因BRCA2[27]、LKB1[28]和USP9X[31]的轉(zhuǎn)基因小鼠模型也不同層面地展示了PanIN和PDAC病變過(guò)程。每種轉(zhuǎn)基因小鼠模型各有特點(diǎn),成瘤時(shí)間、臨床癥狀及生存時(shí)間等情況都有差異,研究人員應(yīng)根據(jù)不同研究目的和實(shí)驗(yàn)條件選擇最佳的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
胰腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型特別是結(jié)合KRAS突變和腫瘤抑制基因如CDKN2A、TP53和SMAD4突變或缺失的模型能夠很好地模擬人類胰腺癌的特征,但幾乎所有的PDAC模型都使用單一的Cre重組酶,這樣所有的癌基因的激活及抑癌基因的失活或缺失都發(fā)生在同一時(shí)間同一細(xì)胞,這種情況下,在已經(jīng)形成的癌前病變或腫瘤中的基因缺失就難以分析;與此同時(shí),細(xì)胞外基質(zhì)與免疫細(xì)胞在侵襲性與轉(zhuǎn)移性腫瘤中的作用也難以評(píng)價(jià)。因此,有待于開(kāi)發(fā)并結(jié)合使用目前有限的胰腺特異重組酶將腫瘤形成事件與促進(jìn)結(jié)締組織增生等事件分開(kāi),獨(dú)立分析。盡管胰腺癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型存在上述缺陷并且造模時(shí)間長(zhǎng),耗資多,但能夠很好地模擬人類PanIN病變和PDAC,產(chǎn)生的臨床價(jià)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原位或異位移植瘤模型,已是目前研究胰腺癌的最有力工具,對(duì)于胰腺癌早發(fā)現(xiàn)早診斷、設(shè)計(jì)有效治療方法具有重要意義。而目前國(guó)內(nèi)胰腺癌轉(zhuǎn)基因模型的研究?jī)HShen等[39]在Pdx1-cre,LSL-KrasG12D,LSL-Trp53R172H/+模型中開(kāi)展過(guò),應(yīng)用十分有限,相信納入胰腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型,我國(guó)的胰腺癌研究水平會(huì)上升到新的層次。
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