桑 松，王培丹，曹宇科，鐘國(guó)華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院／天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

我國(guó)是茶葉生產(chǎn)和出口大國(guó)，年出口量穩(wěn)居世界第二.在全球氣候變化、人類活動(dòng)等因素作用下，茶葉生產(chǎn)過(guò)程中病蟲草害增多，農(nóng)藥使用有增無(wú)減，茶葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)已經(jīng)成為我國(guó)茶葉生產(chǎn)遇到的最大問(wèn)題之一［1］.目前茶葉農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法很多，如色譜分析法、生物傳感器法、免疫分析法、分子印跡技術(shù)等［2］，但這些檢測(cè)方法是針對(duì)產(chǎn)品的檢測(cè)，屬于事后而非過(guò)程監(jiān)測(cè)，且多數(shù)方法離不開(kāi)貴重的儀器，操作較復(fù)雜.生產(chǎn)環(huán)境中施用于作物或種植地的農(nóng)藥，大部分最終殘留在種植地的水體和土壤中，水體環(huán)境中的農(nóng)藥殘留狀況在一定程度上反映了生產(chǎn)過(guò)程中使用農(nóng)藥的種類、數(shù)量或頻率.

生物監(jiān)測(cè)技術(shù)誕生于20世紀(jì)初，它利用生物個(gè)體、種群和群落的數(shù)量、性質(zhì)、健康狀況、生理特性等變化來(lái)表征環(huán)境質(zhì)量的變化，闡明環(huán)境污染狀況，從生物學(xué)角度為環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)［3］.螺是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要食物鏈環(huán)節(jié)，已應(yīng)用于監(jiān)測(cè)底泥重金屬污染［4-5］，但有關(guān)農(nóng)藥對(duì)淡水螺類的影響［6-7］以及將螺作為指示生物對(duì)環(huán)境農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)還鮮見(jiàn)報(bào)道.在實(shí)踐調(diào)查和前期篩選的基礎(chǔ)上，本研究選擇茶園溪水中的山坑螺Margarya melanioides Nevill和田螺 Cipangopaludina chinensis Gray作為試驗(yàn)材料，研究茶葉生產(chǎn)實(shí)踐中公眾關(guān)注度高、重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的代表性農(nóng)藥對(duì)山坑螺和田螺的敏感性，旨在篩選能夠用于監(jiān)測(cè)茶園環(huán)境農(nóng)藥殘留、更加直觀反映茶園環(huán)境質(zhì)量的敏感指示生物.

1 材料與方法

1.1 主要藥劑與供試材料

1.8%（w）阿維菌素乳油，浙江威爾達(dá)化工有限公司生產(chǎn)；25.0%（w）噻蟲嗪水分散粒劑，安徽眾邦生物工程有限公司生產(chǎn)；77.5%（w）敵敵畏乳油，湖北沙隆達(dá)股份有限公司生產(chǎn)；200 g·L-1草銨膦水劑，廣東新景象生物工程有限公司生產(chǎn)；92.0%（w）甲氰菊酯原藥、94.0%（w）毒死蜱原藥，均由南京紅太陽(yáng)股份有限公司提供.

山坑螺Margarya melanioides Nevill采集于廣東省乳源縣某茶園山溪中，體長(zhǎng)為20～25 mm.田螺Cipangopaludina chinensis Gray從廣東省乳源縣某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買，體長(zhǎng)為25～30 mm.

1.2 試驗(yàn)方法

采用靜水生物毒性試驗(yàn)法［8］.先按適當(dāng)比例由低濃度到高濃度進(jìn)行24 h預(yù)試驗(yàn)，由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定各藥劑對(duì)供試螺致死率10%～90%的濃度范圍.正式試驗(yàn)分別設(shè)置敵敵畏、阿維菌素、毒死蜱、草銨膦、噻蟲嗪各5個(gè)質(zhì)量濃度組，甲氰菊酯6個(gè)質(zhì)量濃度組，丙酮-水溶液對(duì)照組（丙酮含量與處理組相同）和1個(gè)空白對(duì)照組（完全為清水，未加丙酮），每組設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)螺.將各組配制好的藥液置于同一規(guī)格的塑料箱（長(zhǎng)×寬×高為25 cm×15 cm×20 cm），每個(gè)塑料箱中加入采自山坑螺原來(lái)生活環(huán)境的溪水3 L、砂石500 g左右，適量水草，然后再加入20個(gè)山坑螺或田螺，試驗(yàn)時(shí)水溫維持在22～27℃并保持12 h光照，試驗(yàn)期間不換液.試驗(yàn)開(kāi)始后8 h內(nèi)連續(xù)觀察，及時(shí)取出死亡螺，每隔24 h觀察記錄螺的死亡個(gè)數(shù)，參考Santos等［9］的方法判斷螺死亡與否.

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

按照Abbott公式計(jì)算死亡率和校正死亡率，采用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算毒力回歸方程、致死中濃度（Median lethal concentration 50，LC50）及 95%置信區(qū)間.

2 結(jié)果與分析

2.1 田螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性

靜水生物毒性試驗(yàn)法的測(cè)定結(jié)果如表1和表2所示.由表1可知，供試田螺對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥最敏感，處理后48 h對(duì)甲氰菊酯的 LC50僅0.0132 mg·kg-1（有效成分濃度）；對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥敵敵畏、毒死蜱以及抗生素類農(nóng)藥阿維菌素的敏感性稍差，LC50值分別為1.711 2、1.501 6和 0.917 1 mg·kg-1；對(duì)新煙堿類的噻蟲嗪以及除草劑草銨膦均不敏感，LC50值分別為119.021 1和108.755 3 mg·kg-1.處理后96 h，敵敵畏、甲氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱、草銨膦和噻蟲嗪對(duì)田螺的LC50值分別為1.038 7、0.006 9、0.295 3、0.752 8、58.966 5、82.919 7 mg·kg-1（表2），與48 h的LC50值相比差異不大，各藥劑的毒力強(qiáng)度次序與48 h均一致.將這些結(jié)果與我國(guó)［10］和歐盟［11］規(guī)定的茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）值相比較可知，供試田螺僅對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥比較敏感，而對(duì)他它5種農(nóng)藥的LC50值遠(yuǎn)高于我國(guó)以及歐盟規(guī)定的茶葉中MRL.

表1 處理48 h田螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性Tab.1 The sensitivity of Cipangopaludina chinensis to six pesticides after 48 h treatment

表2 處理96 h田螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性Tab.2 The sensitivity of Cipangopaludina chinensis to six pesticides after 96 h treatment

2.2 山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性

表3和4總結(jié)了山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性測(cè)定結(jié)果.山坑螺對(duì)有機(jī)磷類的敵敵畏、毒死蜱以及擬除蟲菊酯類的甲氰菊酯非常敏感，處理后48 h的LC50值分別為0.031 6、0.048 6和0.005 2 mg·kg-1，遠(yuǎn)低于歐盟所規(guī)定的MRL值0.1、0.1和2 mg·kg-1；對(duì)阿維菌素也有較高的敏感性，48 h的LC50為0.104 0 mg·kg-1，但是高于歐盟規(guī)定的茶葉中MRL（0.02 mg·kg-1）；對(duì)噻蟲嗪以及草銨膦的敏感性稍差，48 h的LC50值分別為54.635 8和14.417 1 mg·kg-1.處理后96 h，山坑螺對(duì)敵敵畏、甲氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱、草銨膦和噻蟲嗪 LC50值分別為0.021 9、0.002 3、0.017 0、0.022 6、7.833 1、26.102 9 mg·kg-1（表4），其中阿維菌素對(duì)山坑螺96 h的LC50值接近于歐盟所規(guī)定的MRL值（0.02 mg·kg-1）.因此，山坑螺對(duì)有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有非常高的敏感性，可考慮用于監(jiān)測(cè)茶葉種植環(huán)境中的這2類農(nóng)藥殘留.

表3 處理48 h山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性Tab.3 The sensitivity of Margaryamelanioides to six pesticides after 48 h treatment

表4 處理96 h山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性Tab.4 The sensitivity of Margaryamelanioides to six pesticides after 96 h treatment

2.3 田螺和山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性差異

通過(guò)比較處理后48和96 h山坑螺和田螺的LC50值可知，山坑螺比田螺對(duì)6種供試農(nóng)藥更加敏感.處理后48 h敵敵畏、甲氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱、草銨膦及噻蟲嗪對(duì)田螺的LC50值分別是山坑螺的 54.15、2.54、8.82、30.90、7.54和2.18倍，處理后96 h分別是 47.13、3.00、17.37、33.31、7.53和 3.18倍（圖1），尤其是兩者對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥（敵敵畏和毒死蜱）的敏感性相差巨大，阿維菌素和草銨膦的倍數(shù)也較大，說(shuō)明山坑螺對(duì)這些農(nóng)藥的殘留比田螺更加敏感.兩者對(duì)甲氰菊酯和噻蟲嗪的敏感性差異較小，而對(duì)甲氰菊酯LC50的值都較小，對(duì)噻蟲嗪LC50的值都較大，說(shuō)明山坑螺和田螺對(duì)甲氰菊酯都很敏感，而對(duì)噻蟲嗪均不敏感.整體上來(lái)看，山坑螺比田螺顯示出更優(yōu)異的作為農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)指示生物的潛力.

圖1 田螺和山坑螺對(duì)6種農(nóng)藥的敏感性差異Fig.1 The sensitivity differences between Cipangopaludina chinensis and Margaryamelanioides to six pesticides

3 討論與結(jié)論

指示生物法監(jiān)測(cè)環(huán)境污染具有“直觀、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏”的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，這在國(guó)內(nèi)外的重金屬以及農(nóng)藥殘留污染研究和實(shí)踐中已有不少探索.國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將貽貝和牡蠣作為指示生物監(jiān)測(cè)海洋中的鎘、鉛、汞以及丁基錫的污染，通過(guò)測(cè)定體內(nèi)污染物的含量、種類和機(jī)體的生理生化反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)水體的污染狀況［12-13］.兩棲動(dòng)物類中的楔頭蛙Rana sphenocephala［14］、飾紋姬蛙 Microhyla arnata［15］和豹蛙 Rana pipiens［16］也分別被作為指示生物對(duì)西維因、殺螟硫磷以及百草枯殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)敏感物種對(duì)農(nóng)藥的異常反應(yīng)（畸形、行為異常、死亡率提高等）來(lái)判斷農(nóng)藥殘留的污染情況.本研究結(jié)果表明所試山坑螺對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥非常敏感，48 h的LC50值遠(yuǎn)低于我國(guó)以及歐盟所規(guī)定的茶葉中的MRL，可用于茶葉種植園這兩類殺蟲劑殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)；對(duì)阿維菌素也有較高的敏感性，96 h的LC50值接近于歐盟所規(guī)定的MRL值；對(duì)噻蟲嗪以及草銨膦敏感性稍差，可適當(dāng)調(diào)整監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如采用LC5或LC10的劑量進(jìn)行監(jiān)測(cè).山坑螺對(duì)茶葉生產(chǎn)中重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的農(nóng)藥比較敏感，可考慮用于茶園環(huán)境農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè).

山坑螺比田螺更適合用于茶園環(huán)境農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè).一般認(rèn)為生物監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性取決于敏感生物的敏感性，敏感性越高，結(jié)果越準(zhǔn)確可靠［17］.田螺一般生活在淡水水草茂盛的湖泊、水庫(kù)、溝渠、池塘內(nèi)，主要食植物嫩莖葉、腐屑生物等，耐污性強(qiáng)；而山坑螺對(duì)水質(zhì)要求較高，只能生長(zhǎng)于水流清澈、沒(méi)有污染的山間流動(dòng)溪水中，已有報(bào)道認(rèn)為該螺對(duì)除草劑丁草胺和丁芐混劑殘留濃度較敏感［7］.本研究結(jié)果表明，敵敵畏、甲氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱、草銨膦以及噻蟲嗪對(duì)田螺48 h的LC50值分別是山坑螺的54.15、2.54、8.82、30.90、7.54和 2.18倍，尤其是兩者對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥（敵敵畏和毒死蜱）的敏感性相差巨大，山坑螺比田螺顯示出更優(yōu)異的作為農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)指示生物的潛力.

山坑螺用于茶園環(huán)境農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)仍需進(jìn)一步深入研究.利用敏感指示生物監(jiān)測(cè)農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)不能定量，也不具有特異性，只能定性地檢出茶園水體中農(nóng)藥是否超標(biāo)，但不能確定殘留為何種農(nóng)藥以及殘留量多少.從本研究的結(jié)果看，只要茶園水體中殘留有少量的有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，水體中的山坑螺就會(huì)大量死亡，可指示茶園中這2類殺蟲劑可能超標(biāo).在生產(chǎn)實(shí)踐中可在每個(gè)茶園中的水體中取適量的水，放入一定量的山坑螺，48 h后檢查螺的死亡情況，以監(jiān)測(cè)農(nóng)藥殘留是否超標(biāo).用山坑螺監(jiān)測(cè)茶園環(huán)境農(nóng)藥殘留原料便宜、方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，該方法的推廣可以提高茶農(nóng)對(duì)茶園農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)的主動(dòng)性，對(duì)于保障茶葉產(chǎn)品的安全具有一定的積極意義.

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