王 燕，王春偉，高 潔，許允成，崔麗麗

(1吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春 130118;2中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130118)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的殘留動態(tài)及最終殘留量

王 燕1，王春偉1，高 潔1，許允成1，崔麗麗2

(1吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春 130118;2中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130118)

【目的】明確在人參生長期施用250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油在人參根、莖、葉和土壤中的殘留動態(tài)及最終殘留量.【方法】樣品經(jīng)丙酮提取，N-丙基乙二胺(PSA)固相萃取柱凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測.【結(jié)果和結(jié)論】施藥劑量為666.67 g·hm-2(以有效成分計)時，吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的降解半衰期為6.35～8.75 d.施藥劑量為333.33～666.67 g·hm-2時，施藥后60 d吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的最終殘留量低于0.020 6 mg·kg-1，因此建議施用250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油時，施藥劑量不高于666.67 g·hm-2，施藥1次，安全間隔期為35 d.

人參;吡唑醚菌酯;殘留動態(tài);最終殘留量;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)為N-［2-［1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-3-基氧甲基］苯基］(N-甲氧基)氨基甲酸甲酯，分子式為C19H18ClN3O4［1］，為新型廣譜殺菌劑，通過抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長而發(fā)揮藥效，其抑菌機理是通過阻止細胞色素b和c1間電子傳遞而抑制線粒體的呼吸作用，使線粒體不能產(chǎn)生和提供細胞正常代謝所需要的能量(ATP)，最終導(dǎo)致細胞死亡［2］.目前吡唑醚菌酯已廣泛應(yīng)用于100多種作物上，可有效防治由子囊菌綱、擔子菌綱、卵菌綱和半知菌類真菌引起的病害［3-4］.近年來吡唑醚菌酯廣泛用于防治人參黑斑病和人參灰霉病.

為有效控制人參中吡唑醚菌酯的殘留量，保障我國人參生產(chǎn)和安全，研究人參中吡唑醚菌酯的殘留動態(tài)及殘留量具有重要意義.吡唑醚菌酯的檢測方法主要有氣相色譜法［5-6］、高效液相色譜法［7-11］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［12-15］，其在黃瓜、辣椒、白菜、草莓、葡萄、西瓜、花生、甘藍中的殘留檢測方法有報道［5-15］，但采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定吡唑醚菌酯在人參和土壤中的殘留動態(tài)及最終殘留量，國內(nèi)外鮮見報道.本試驗建立了人參根、莖、葉及土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，并研究了250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油在人參根、莖、葉和土壤中的消解動態(tài)及最終殘留量，為我國吡唑醚菌酯在人參中的最大殘留限量標準的建立提供理論參考，為吡唑醚菌酯在人參上安全、合理地使用提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

供試作物：4年生人參Panax ginsengC.A.Meyer，品種為大馬牙;試驗地點：吉林省撫松縣興參鎮(zhèn)榆樹村和集安市大地參業(yè)人參種植基地.

甲苯、丙酮、乙腈(均為優(yōu)級純);甲酸(分析純);水為GB/T 6682規(guī)定的一級水;250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油(德國巴斯夫(中國)有限公司);吡唑醚菌酯標準品(國家標準物質(zhì)信息中心)，純度(w)為99.5%.

API 4000型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);Agilent 1200高效液相色譜儀(美國 Agilent公司);Kromasil Eternity-5-C18色譜柱(瑞典AKZO NOBEL公司);PSA固相萃取柱(500 mg·6 mL-1，美國 Supelco公司);離心機(10 000 r·min-1，美國Beckman coulter公司);渦漩混勻器(德國IKA公司);Mettler PL1500-s電子天平(0.01 g);組織搗碎機(20 000 r·min-1);0.22 μm濾膜等.

1.2 試驗方法

1.2.1 消解動態(tài)試驗 試驗共設(shè)高劑量和不施藥空白對照2個處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積為15 m2.施藥劑量為666.67 g·hm-2.施藥后0(在施藥后2 h之內(nèi))、1、3、7、14、21、28和35 d分別采集人參根、莖、葉及土壤樣品，每小區(qū)按對角線取5點，土壤樣品采集深度為0～10 cm，四分法留樣.同期采集空白樣品，標記后于-20℃條件下保存待測［16］.

1.2.2 最終殘留試驗 試驗設(shè)2個施藥濃度處理，分別為333.33和666.67 g·hm-2，設(shè)不施藥空白對照小區(qū)，每處理重復(fù)3次.在施藥后21、28、35和60 d采集人參根、莖、葉和土壤樣品，土壤樣品采樣深度為0～15 cm，采樣方法同1.2.1.

1.2.3 樣品測定前處理方法 干人參根樣品的制備：稱取-20℃冷凍保存的鮮人參根、莖、葉樣品100 g，依次用組織搗碎機將樣品粉碎，將粉碎后的鮮人參根樣品平鋪，置于50℃條件下2 h將樣品烘干，備用.

提取：取5 g人參根、莖、葉、土壤及干人參根樣品于50 mL離心管中，加入丙酮20 mL，渦漩混勻1 min后8 000 r·min-1離心5 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL丙酮，重復(fù)提取1次，合并上清液于35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入V(乙腈)∶V(甲苯)=3∶1的溶液5 mL溶解，待凈化.

凈化：10 mLV(乙腈)∶V(甲苯)=3∶1溶液預(yù)淋洗PSA固相萃取柱，棄流出液;將5 mL溶解液倒入PSA固相萃取柱中，用20 mLV(乙腈)∶V(甲苯)= 3∶1的溶液進行洗脫;收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干;用乙腈溶解，并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供LC-MS/MS測定.

1.2.4 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Kromasil Eternity-5-C18，2.1 mm×150 mm;柱溫度40℃;進樣量10 μL;流動相：V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=90.00∶9.99∶0.01;流速：250 μL·min-1.離子源為電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測;電噴霧電壓5 500 V;霧化氣壓力為0.483 MPa;氣簾氣壓力為0.138 MPa;輔助加熱氣壓力為0.379 MPa;離子源溫度為725℃;吡唑醚菌酯的定量離子(m/z)為388.0/194.0;定性離子(m/z)為388.0/194.0，388.0/163.0;去簇電壓為6 V;碰撞氣能量為19和29 eV.

1.2.5 標準曲線制作 準確稱取吡唑醚菌酯標準品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用丙酮溶解，并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，用人參空白基質(zhì)液稀釋、定容，配制0.001、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg·mL-17個系列標準溶液.以質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，建立回歸方程.

1.2.6 添加回收率試驗 取空白對照區(qū)人參根、莖、葉和土壤樣品進行添加回收率試驗.共設(shè)3個添加水平，分別添加質(zhì)量濃度為0.01、0.02和0.20 mg·kg-1的標準溶液，每個添加試驗設(shè)定10個平行和1個對照，計算添加回收率和相對標準偏差.

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢出限

吡唑醚菌酯在0.001～1.00 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.74×107x+6.84×105，相關(guān)系數(shù)r= 0.997 3.在所設(shè)定的儀器條件下，以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，吡唑醚菌酯的檢出限為0.001 mg·kg-1.

2.2 添加回收率試驗

從表1可知：吡唑醚菌酯在添加質(zhì)量分數(shù)為0.01～0.20 mg·kg-1，人參根、莖、葉及土壤的回收率范圍分別為87.2% ～89.7%、85.8% ～89.5%、87.6%～94.8%和88.0%～91.3%，相對標準偏差分別為7.49%～9.39%、5.32%～7.54%、5.97%～8.75%和6.30%～8.05%.說明該方法對吡唑醚菌酯具有良好的分離效果，其靈敏度和準確度均符合農(nóng)藥殘留分析要求.

表1 吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉及土壤中的回收率1)Tab.1 The recovery of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil

2.3 殘留動態(tài)試驗

表2 吡唑醚菌酯在集安人參根、莖、葉和土壤中的殘留動態(tài)Tab.2 Residual dynamics of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil of Ji’an City

吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉、土壤和干人參根中的殘留降解動態(tài)符合一級反應(yīng)動力學方程Ct=C0e-kt，其中Ct為施藥后間隔時間為t時的農(nóng)藥質(zhì)量分數(shù);C0為施藥后的原始沉積量;k為降解速率常數(shù);t為施藥后的時間.由此可求出降解半衰期t1/2= ln2·k-1.由表2和表3可知：吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的降解半衰期范圍為6.35～8.75 d.由表4可知：250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油在集安和撫松干人參根中的降解半衰期分別為7.67和7.94d. 250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油施藥后60 d在集安和撫松干人參根中的最終殘留量分別為 0.013 2和0.012 1 mg·kg-1，說明其半衰期較短，屬于易降解農(nóng)藥(t1/2＜30 d).

表3 吡唑醚菌酯在撫松人參根、莖、葉和土壤中的殘留動態(tài)Tab.3 Residual dynamics of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil of Fusong County

表4 吡唑醚菌酯在干人參根中的殘留動態(tài)Tab.4 Residual dynamics of pyraclostrobin in dried ginseng root

2.4 最終殘留試驗

在集安市進行的最終殘留試驗結(jié)果(表5)表明：在施藥劑量為666.67 g·hm-2時，施藥后60 d吡唑醚菌酯在人參根、葉和土壤中的殘留量分別為0.005 3、0.004 4和0.002 2 mg·kg-1在人參莖中未檢出殘留.在施藥劑量為333.33 g·hm-2時，施藥后60 d吡唑醚菌酯除在人參根中殘留量為0.002 5 mg·kg-1，人參莖、葉和土壤中均未檢出殘留.在撫松縣進行的最終殘留試驗結(jié)果(表5)表明：施藥劑量為666.67 g·hm-2時，施藥后60 d吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的殘留量分別為0.0021、0.0206、0.0183和0.0058 mg·kg-1;在施藥劑量為333.33 g·hm-2時，施藥后60 d吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中殘留量分別為0.002 5、0.013 2、0.016 7 mg·kg-1和未檢出.

表5 吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的最終殘留1)Tab.5 Final residues of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil

3 討論與結(jié)論

人參基質(zhì)成分復(fù)雜，包括多種皂甙、有機酸、多糖及酯類等，在農(nóng)藥檢測過程中易產(chǎn)生假陽性，影響結(jié)果的準確性與靈敏度.傳統(tǒng)的色譜分析方法提取、凈化等處理步驟繁瑣、復(fù)雜，操作耗時費力.HPLCMS/MS是以質(zhì)譜儀為檢測手段，集高效液相色譜(HPLC)的高分離能力與質(zhì)譜(MS)的高靈敏度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有靈敏度高、廣譜性強、抗干擾好等優(yōu)點.本試驗根據(jù)人參樣品基質(zhì)的特性，對提取、凈化等處理步驟進行了優(yōu)化，建立了人參根、莖、葉及土壤中吡唑醚菌酯的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜殘留檢測方法.該方法的精密度、靈敏度、回收率等方面均符合農(nóng)藥殘留檢測要求，且操作簡便、快捷，能滿足生產(chǎn)上對吡唑醚菌酯殘留檢測限量的要求.

殘留試驗結(jié)果表明，吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的降解半衰期為6.35～8.75 d，半衰期較短，為易降解農(nóng)藥(t1/2＜30 d).我國尚未制定吡唑醚菌酯在人參中的最大殘留限量標準.加拿大(http：∥www.pmra-arla.gc.ca/english/legis/maxres-e.html)規(guī)定吡唑醚菌酯在人參中最大殘留限量值為0.40 mg·kg-1，歐盟(http：∥ec.europa.eu/food/ plant/protection/pesticide/index_en.htm)和韓國(http：∥www.kfda.go.kr/cgi-bin/t4.cgi/eng/english_ 12.taf)規(guī)定吡唑醚菌酯在人參中最大殘留限量值分別為0.05和2.00 mg·kg-1.我國規(guī)定吡唑醚菌酯在結(jié)球甘藍、大白菜、黃瓜、辣椒、馬鈴薯、蘋果、西瓜、甜瓜、葡萄和香蕉上的最大殘留限量值分別為0.50、5.00、0.50、0.50、0.02、0.50、0.50、0.50、2.00和0.02 mg·kg-1［17］.參照以上殘留限量及本試驗殘留數(shù)據(jù)，建議在人參生長期施用250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油時，施藥劑量不高于666.67 g·hm-2，施藥1次，安全間隔期為35 d.

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【責任編輯 霍 歡】

Determination of residual dynamics and final residues of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil by HPLC-MS/MS

WANG Yan1，WANG Chunwei1，GAO Jie1，XU Yuncheng1，CUI Lili2
(1 College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 2 Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130118，China)

【Objective】To identify the residual dynamics and final residues of pyraclostrobin 250 g·L-1EC in the ginseng root，stem，leaf and soil after spraying during the ginseng growth period.【Method】The samples were extracted with acetone，cleaned up with primary secondary amine(PSA)solid phase extraction cartridge，and determined by high performance liquid chromatography coupled with electrospray mass spectrometry(HPLC-MS/MS).【Result and conclusion】The half lives of pyraclostrobin were from 6.35 to 8.75 d in the ginseng root，stem，leaf and soil with a spraying dosage of 666.67 g·hm-2.Final residues of pyraclostrobin in the ginseng root，stem，leaf and soil were below 0.020 6 mg·kg-1over 60 d at a spraying dosage ranging from 333.33 to 666.67 g·hm-2.It is recommended that the preharvest interval of pyraclostrobin 250 g·L-1EC should be set 35 d and sprayed one time at the dosage of no more than 666.67 g·hm-2.

ginseng;pyraclostrobin;residual dynamics;final residue;HPLC-MS/MS

S481.8

A

1001-411X(2014)03-0069-05

2013-10-08 優(yōu)先出版時間：2014-03-31

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.013.html

王 燕(1987—)，女，博士研究生，E-mail:yan314319@163.com;通信作者:高 潔(1964—)，女，教授，博士，E-mail:jiegao115@126.com

吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Z24);吉林省人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目(2011省財政廳)王 燕，王春偉，高 潔，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究吡唑醚菌酯在人參根、莖、葉和土壤中的殘留動態(tài)及最終殘留量［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35(3)：69-73.