鄭培烝，鄒 紅，傅芬蕊，潘玉紅，黃心宏，曹穎平

重癥監(jiān)護(hù)室耐碳青酶烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的基因分型

鄭培烝，鄒 紅，傅芬蕊，潘玉紅，黃心宏，曹穎平

目的了解筆者醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。方法收集2010年9月－2012年3月ICU分離的CRAB共34株，其中綜合ICU 25株，燒傷ICU 9株，采用基于rep-PCR原理的DiversiLab系統(tǒng)進(jìn)行基因分型分析。結(jié)果34株CRAB共分A、B、C和D 4型，燒傷ICU中存在A和D型，以A型為主且A型僅出現(xiàn)在燒傷ICU；綜合ICU中存在B，C和D型，以D型為主且B和C型僅出現(xiàn)在綜合ICU。結(jié)論燒傷ICU和綜合ICU中流行的CRAB基因型不同。D型CRAB同時(shí)存在兩個(gè)ICU中提示ICU間可能存在交叉感染。

鮑氏不動(dòng)桿菌；不動(dòng)桿菌感染；抗菌藥；青霉屬；碳；聚合酶鏈反應(yīng)；基因；序列分析，DNA

鮑曼不動(dòng)桿菌是一群不發(fā)酵糖類和氧化酶陰性的革蘭陰性球桿菌。隨著抗生素廣泛應(yīng)用所產(chǎn)生的選擇性壓力，目前鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)現(xiàn)有幾乎所有種類的抗生素的敏感性逐年下降，特別是對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年上升越來越受到關(guān)注。耐碳青酶烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）是引起醫(yī)院感染的常見病原菌之一［1］。對(duì)其進(jìn)行分子流行病學(xué)監(jiān)測對(duì)控制CRAB的傳播，及早和準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)耐藥菌株來源和確定傳播方式至關(guān)重要。

基于DNA重復(fù)序列PCR（repetitive element PCR，rep-PCR）技術(shù)的DiversiLab分型系統(tǒng)具有操作簡便、反應(yīng)快速、重復(fù)性好等特點(diǎn)，其分型結(jié)果與脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）有較好的一致性，已成為醫(yī)院感染分子流行病學(xué)研究的理想方法之一［2］。因此，本研究采用DiversiLab分型系統(tǒng)對(duì)CRAB菌株進(jìn)行基因分型和同源性分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集筆者醫(yī)院2010年9月—2012年3月間燒傷ICU和綜合ICU分離到的CRAB，標(biāo)本類型有痰、血液、尿液和胸腹水等。

1.2 儀器和試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（VITEKⅡCompact型，法國生物梅里埃公司）；生物分析儀（2100型，美國 Agilent公司）；藥敏卡（批號(hào)：106197910，法國生物梅里埃公司）；超純微生物DNA提取試劑盒（批號(hào)：BMX11A7，美國 MOBIO公司）；鮑曼不動(dòng)桿菌rep-PCR分型試劑盒（批號(hào)：AC061201，法國生物梅里埃公司）；DiversiLab DNA芯片（批號(hào)：QC20RK01，法國生物梅里埃公司）。

1.3 菌種鑒定 所有CRAB菌株經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，同時(shí)做42℃培養(yǎng)和氧化－發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證。使用藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，亞胺培南和／或美羅培南耐藥的不動(dòng)桿菌再通過K-B法驗(yàn)證是否對(duì)亞胺培南和／或美羅培南耐藥。以上藥敏結(jié)果根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2012年版的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷［3］。鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌且亞胺培南和／或美羅培南耐藥的菌株共34株。

1.4 基因分型

1.4.1 DNA提取 取MH平板上過夜培養(yǎng)的菌落用于DNA提取，按照超純微生物DNA提取試劑盒操作說明書提取細(xì)菌基因組DNA，測定其OD260／280值，調(diào)整濃度在30～70mg／L之間。

1.4.2 rep-PCR 擴(kuò)增 根據(jù)鮑曼不動(dòng)桿菌rep－PCR分型試劑盒的要求，配制25μL PCR反應(yīng)體系：重復(fù)序列PCR MMI 18μL，GeneAmp＠10×PCR緩沖液2.5μL，引物混合物2μL，AmpliTaq＠DNA聚合酶0.5μL，基因組DNA模板2μL。反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性94℃2min→變性94℃30s→退火50℃30s→延伸70℃90s，共35個(gè)循環(huán)，70℃延伸3min。

1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 將PCR產(chǎn)物用配套的DiversiLab DNA芯片和生物分析儀檢測。

1.4.4 結(jié)果分析 使用DiversiLab分型系統(tǒng)配套軟件分析，得到各菌株相應(yīng)的電泳圖及進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 CRAB基因分型結(jié)果 共收集并確證CRAB標(biāo)本34株，其中燒傷ICU 9株，綜合ICU 25株。34株菌株顯示A、B、C、D四個(gè)型別，其中A型7株，只出現(xiàn)在燒傷ICU；B型2株和C型1株，只出現(xiàn)在綜合ICU；D型24株，燒傷ICU 2株和綜合ICU 22株（圖1）。

2.2 34株CRAB間同源性分析 不同菌株間的同源性用不同顏色來表示，深紅色表示菌株間同源性為95%～100%，淺紅色為90%～95%，藍(lán)色為80%～90%，黃色為70%～80%，灰色則低于70%。從圖中可看出各型CRAB的不同菌株間都有很好的同源性。A型和B型CRAB間的同源性較好，但與D型CRAB間的同源性較差（圖2）。

3 討 論

圖2 34株ICU分離的CRAB同源性分析Fig 2 Homologous analysis of 34CRAB strains isolated from ICUs patients

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院感染的常見病原菌之一，特別是在ICU和血液科等特殊科室，主要導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、傷口感染和敗血癥等疾病。CRAB往往表現(xiàn)出多重耐藥的特性，它的出現(xiàn)和流行使得臨床治療變得十分困難，病死率較高［4］。為了控制CRAB傳播，及早和準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)耐藥菌株來源和型別鑒定十分重要。本研究通過基于rep-PCR的DiversiLab分型系統(tǒng)對(duì)34株臨床分離的CRAB進(jìn)行基因分型，將其分為4種基因型，說明這些菌株來源不同。燒傷ICU存在A型和D型CRAB，其中A型比例達(dá)到77.8%，說明A型是燒傷ICU中的流行株，而且A型僅出現(xiàn)在燒傷ICU不存在于綜合ICU提示A型CRAB來源于燒傷ICU自身。在綜合ICU中存在B、C和D型，其中D型占88.0%，說明D型是綜合ICU的流行株。D型同時(shí)存在于燒傷ICU和綜合ICU提示兩個(gè)ICU間可能存在交叉感染。

引起ICU中CRAB流行的傳染源主要來源于感染或定植CRAB的患者和環(huán)境中的CRAB，這就要求醫(yī)務(wù)工作者增強(qiáng)醫(yī)院感染的防控意識(shí)，重視手衛(wèi)生，切斷可能的傳播途徑，同時(shí)要注意環(huán)境的監(jiān)測和消毒工作。發(fā)現(xiàn)CRAB感染的患者應(yīng)及時(shí)采取隔離措施，防止感染的進(jìn)一步爆發(fā)。

目前用于鮑曼不動(dòng)桿菌的基因分型主要方法是PFGE。PFGE是公認(rèn)的微生物分子分型方法的金標(biāo)準(zhǔn)［5］。但是PFGE操作復(fù)雜，所需時(shí)間長，不同實(shí)驗(yàn)室之間的可重復(fù)性較差，不利于不同實(shí)驗(yàn)室間的比較。DiversiLab分型系統(tǒng)是一款基于rep-PCR原理的微生物基因分型系統(tǒng)，可使樣本準(zhǔn)備、rep－PCR、電泳及結(jié)果分析能在短時(shí)間內(nèi)完成，操作簡單，重復(fù)性好。DiversiLab分型系統(tǒng)配套的分析軟件是一款基于網(wǎng)絡(luò)在線分析的軟件，這為不同實(shí)驗(yàn)室間菌株的比對(duì)提供了便利，同時(shí)也為數(shù)據(jù)庫的建立提供條件。通過比較筆者實(shí)驗(yàn)室和國內(nèi)外其他實(shí)驗(yàn)室利用DiversiLab分型系統(tǒng)對(duì)CRAB進(jìn)行基因分型的圖譜［6－8］，發(fā)現(xiàn)筆者醫(yī)院ICU中CRAB流行株的基因型和別的實(shí)驗(yàn)室不盡相同，提示不同地區(qū)流行的CRAB來源于不同的克隆株，同時(shí)也說明建立本地區(qū)CRAB監(jiān)控平臺(tái)的重要性。目前Diversi－Lab分型系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、分枝桿菌屬、念珠菌屬和曲霉菌的基因分型，已被證明是微生物分子流行病學(xué)研究很好的平臺(tái)［9－11］。

下階段將在CRAB分子流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)上對(duì)其耐藥分子機(jī)制和抗菌藥物敏感試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，這將對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、延緩耐藥性的發(fā)生和發(fā)現(xiàn)新的耐藥類型等方面有重要意義。

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（編輯：張慧茹）

Genotyping of Carbapenem-resistant Acinetobacter Baumannii Strains Isolated from Intensive Care Units

ZHENG Peizheng，ZOU Hong，F(xiàn)U Fenrui，PAN Yuhong，HUANG Xinhong，CAO Yingping
Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China

ObjectiveTo investigate the molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii（CRAB）strains collected from intensive care units（ICUs）in our hospital.Methods34 CRAB strains were collected and isolated at ICUs of our hospital during the period of September 2010to April 2012，of which 25from general ICU，and 9from Burn ICU. Genotyping was performed by Diversilab repetitive element PCR system.. ResultsThere were 4types of CRAB strains，including type A，B，Cand D. Type A and D CRAB strains existed in Burn ICU Type A dominated. Type B，C and D CRAB strains were found in general ICU with Type D dominant.ConclusionThe epidemic strains of CRAB in Burn ICU was different from that in general ICU，and the type D CRAB strain appeared simultaneously in both the ICUs suggesting that a cross infection may prevail in the two ICUs.

Acinetobacter baumannii；Acinetobacter infections；anti-bacterial agents；penicillium；carbon；polymerase chain reaction；genes；sequence analysis，DNA

R378.7；R394.2；R978.1

A

1672-4194（2014）01-0057-03

2013-11-19

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，福州 350001

鄭培烝（1974－），男，主任技師，副教授，醫(yī)學(xué)博士.Email：zhengpeizheng＠aliyun.com