陳繼承，康 潔，高碧珍，廖凌虹，丁珊珊

尿酸對人腎小管上皮細胞HK-2纖維化相關(guān)調(diào)控因子的影響

陳繼承，康 潔，高碧珍，廖凌虹，丁珊珊

目的觀察不同濃度尿酸對人腎小管上皮細胞（HK-2）相關(guān)纖維化調(diào)控因子的影響，探討建立尿酸誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞纖維化模型，為尿酸性腎纖維化疾病的研究提供細胞模型。方法以不同濃度的尿酸刺激 HK-2細胞6，12，24，36h，MTT檢測細胞活性抑制率；Real-Time PCR檢測TGF-β1、CTGF、α-SMA mRNA的表達，觀察尿酸對HK-2細胞的促纖維化作用；26mg／dL濃度尿酸刺激HK-2細胞24h，免疫組織化學(xué)檢測TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白的改變。結(jié)果尿酸刺激后細胞活性抑制率與對照組比較明顯升高（P＜0.05），呈時間依賴性；尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA的表達量與對照組比較明顯增加（P＜0.05），并呈劑量依賴性；尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白的表達量與對照組比較明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論尿酸可抑制 HK-2細胞增殖；采用尿酸誘導(dǎo)HK-2細胞，可建立腎纖維化的細胞模型。

尿酸；上皮細胞；腎小管；纖維化；免疫組織化學(xué)；聚合酶鏈反應(yīng)

隨著生活水平提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年遞增。當尿酸長期沉積于腎臟，可造成腎實質(zhì)損害，最終導(dǎo)致腎纖維化。目前腎纖維化動物模型較多，而細胞模型較少，建立合適的腎纖維化細胞模型，對進一步研究高尿酸血癥所致的腎纖維化的機制和防治，具有積極的意義。在高尿酸血癥最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的過程中有多種纖維化因子，如轉(zhuǎn)移生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、α平滑肌肌動蛋白（αsmooth activator protein，α-SMA）參與其中。本實驗擬觀察不同濃度尿酸對腎小管上皮細胞相關(guān)纖維化調(diào)控因子表達水平的影響，探討建立腎纖維化的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑 人腎小管上皮細胞（HK-2細胞，美國 ATCC 細胞庫）。尿酸 （批號：STBC0525V，美國Sigma公司）；MTT（批號：M2128，美國Sigma公司）；胎牛血清（批號：911585，美國Gibco公司）；Trizol RNA抽提試劑（批號：9108，日本TaKaRa公司）；SYBR Green PCR Master mix（批號：RR420A，日本TaKaRa公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：FSQ-201，日本 TOYOBO公司）；TGF-β1、CTGF、α-SMA、β－肌動蛋白（β-actin）引物（上海生工生物 工 程 有 限 公 司）；兔 抗 人 TGF－β1、CTGF、α-SMA抗體（批號：bs-0103R，北京博士德公司）。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（150型，美國 Thermo公司）；潔凈工作臺（SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置熒光相差顯微鏡（Ti-S型，日本尼康公司）；實時熒光定量PCR儀（epgradient型，德國Eppendorf公司）；連續(xù)波長多功能酶標儀（Infinite M200F200型，奧地利TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 HK-2細胞培養(yǎng) 細胞置于含10%胎牛血清、100U／mL 青霉素和 100μg／mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，至細胞生長達80%匯合后進行傳代。實驗所用的細胞均為第3～5代細胞。取匯合達80%的細胞經(jīng)胰酶消化制成細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細胞同步處于G0期。

取培養(yǎng)后同步處于G0期的HK-2細胞，按繼續(xù)培養(yǎng)條件的不同分為4組：（1）對照組：僅使用RPMI 1640；（2）U1組：RPMI 1640＋10mg／dL尿酸；（3）U2組：RPMI 1640＋21mg／dL尿酸；（4）U3組：RPMI 1640＋26mg／dL尿酸。每組均培養(yǎng)4瓶細胞。上述細胞在不同培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)6，12，24，36h，到達相應(yīng)時間后用胰酶消化，離心后抽提總RNA。每個時間段均重復(fù)6次。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 常規(guī)消化收集處于對數(shù)生長期的 HK-2細胞，按每孔104接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞同步于G0期，按上述分組情況各加入200μL培養(yǎng)基。另設(shè)空白對照孔：只加完全培養(yǎng)基（不加細胞，用于調(diào)零）。每種濃度設(shè)9個復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)6，12，24，36h后，每孔去原培養(yǎng)液后加入100μL（0.5mg／mL）MTT，37℃孵育4h，棄除MTT，然后每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩約10min，溶解形成的結(jié)晶，在492nm波長處，用酶標儀檢測OD值，空白對照孔調(diào)零。以上各組實驗均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 HK-2細胞總RNA抽提及cDNA制備 應(yīng)用Trizol試劑抽提細胞總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。反應(yīng)體系如下：2μg模板RNA，65℃熱變性5min，立即置于冰上冷卻，加入4μL的5×RT Master Mix，加入 Nuclease-free Water至終體積20μL。反應(yīng)參數(shù)如下：37℃15min→52℃5min→98℃5min。－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Real-time PCR 擴 增 TGF-β1、CTGF、α-SMA、β-actin基因引物序列見表1。采用看家基因β-actin進行標化。取同一個cDNA為模板進行TGF-β1、CTGF、α-SMA、β-actin的 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：2μL cDNA，12.5μL 2×SYBR Green PCR Master mix試劑，0.5μL引物，加超純水至終體積25μL。反應(yīng)參數(shù)如下：95℃30s→95℃5s→60℃30s，40個循環(huán)，得出各反應(yīng)的擴增曲線和Ct值。采用相對定量2－△△Ct法比較各基因的表達差異［1］。以對照組表達量為1，2－△△Ct值即為尿酸干預(yù)后較對照組基因表達的倍數(shù)。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 細胞免疫組織化學(xué) 將清潔滅菌蓋玻片置于6孔板中，每孔接種細胞懸液（105／mL）2mL，培養(yǎng)24h后，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將細胞分成對照組和含26mg／dL尿酸組，繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出細胞爬片，用PBS漂洗，2min×3次。4%多聚甲醛室溫固定20min后進行細胞免疫化學(xué)檢測。簡要染色步驟如下：0.5%TritionX-100室溫處理20min，PBS漂洗后，3%H2O2室溫孵育10min

2 結(jié) 果

2.1 尿酸對HK-2細胞增殖的影響 不同濃度的尿酸（0，10，21，26mg／dL）刺激 HK-2細胞6，12，24，36h后，與對照組比較，尿酸刺激后細胞活性抑制率均有明顯上升。其中在同一作用時間下，隨著尿酸濃度增加，細胞活性抑制率呈劑量依賴性逐步增加；在同一濃度作用下，隨著作用時間增加，中高濃度細胞活性抑制率呈時間依賴性逐步增加，低濃度先增高后降低?？梢娔蛩釋K-2細胞的作用呈劑量依賴性（圖1）。滅活內(nèi)源性過氧化酶活性，PBS漂洗，檸檬酸高溫抗原修復(fù)，正常山羊血清孵育20min封閉非特異結(jié)合位點，兔抗人TGF－β1、CTGF、α-SMA抗體工作液4℃過夜，PBS漂洗后相繼與二抗及SABC試劑各孵育20min，PBS漂洗，DAB顯色和蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水后中性樹膠封片。顯微鏡觀察細胞形態(tài)并隨機選取3個視野拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件測量區(qū)域內(nèi)積分光密度平均值。

圖1 尿酸對HK-2細胞增殖的影響Fig 1 The influence of uric acid in HK -2cell proliferation

2.2 尿酸對 HK-2細胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA mRNA表達的影響

2.2.1 尿酸對 HK-2細胞 TGF－β1mRNA 表達的影響 不同濃度尿酸刺激6，12，24h后，各組HK－2細胞TGF－β1mRNA表達持續(xù)上調(diào)；36h后表達有所降低，但仍高于對照組。24h時中高濃度作用差別有統(tǒng)計學(xué)意義（vs其他組，P＜0.05），其他時間段不同濃度之間作用差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 尿酸對 HK-2細胞 TGF-β1mRNA 表達的影響（2－△△Ct）Tab 2 The effect of uric acid on HK-2cells expression of TGF－β1mRNA（2－△△Ct）

2.2.2 尿酸對HK-2細胞CTGF mRNA表達的影響 不同濃度尿酸培養(yǎng)不同時間后的各組HK-2細胞CTGF mRNA表達水平均高于對照組；隨時間增加，CTGF mRNA表達先增高后降低；24h時高濃度作用差別有統(tǒng)計學(xué)意義（vs中低濃度，P＜0.05），其他時間段不同濃度之間作用差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 尿酸對HK-2細胞CTGF mRNA表達的影響（2－△△Ct）Tab 3 The effect of uric acid on HK-2cells expression of CTGF mRNA（2－△△Ct）

2.2.3 尿酸對 HK-2細胞α-SMA mRNA 表達的影響 不同濃度尿酸刺激不同時間后的各組HK-2細胞α-SMA mRNA表達水平均高于正常組；隨著時間增加，中低濃度（10，21mg／dL）α-SMA mRNA表達隨時間增加而升高，而高濃度（26mg／dL）隨時間增加而先升高后降低；24h時高濃度作用差別有統(tǒng)計學(xué)意義（vs中低濃度，P＜0.05），其他時間段不同濃度之間作用差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

2.3 26mg／dL 尿 酸 對 HK-2 細 胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表達的影響 TGF-β1、CTGF、α-SMA均表達于細胞胞質(zhì)中。26mg／dL尿酸培養(yǎng)24h后 TGF-β1、CTGF、α-SMA 蛋白表達水平顯著增高（vs對照組，P＜0.01，表5，圖2）。

表4 尿酸對 HK-2細胞α-SMA mRNA表達的影響（2－△△Ct）Tab 4 The effect of uric acid on HK-2cells expression of α-SMA mRNA（2－△△Ct）

表5 26mg／dL尿酸對 HK-2細胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表達的影響（IOD）Tab 5 The effect of uric acid on HK-2cells expression of TGF-β1，CTGF，α-SMA protein（IOD）

圖2 各組 TGF－β1、CTGF、α-SMA 蛋白表達的比較（ ×400）Fig 2 The comparison of TGF-β1，CTGF，α-SMA protein expression（ ×400）

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是各類腎臟疾病進入終末期腎衰的共同途徑，在腎臟疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸中起著重要作用［2］。近年來，腎間質(zhì)纖維化日益得到眾多研究者的重視。腎纖維化主要與間質(zhì)成纖維細胞的增生及細胞外基質(zhì)的過度堆積有關(guān)。Strutz等于1995年首先證實腎小管上皮細胞能夠轉(zhuǎn)化為間質(zhì)成纖維細胞，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機制之一［3－4］。許多細胞因子參與腎纖維化，其中TGF－β1是眾多因子中最關(guān)鍵的促纖維化因子［5］，參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的各個環(huán)節(jié)。CTGF是TGF－β1引起的即刻早期基因表達的產(chǎn)物，是TGF－β1促纖維化活性的下游信號分子之一。研究表明，CTGF通過促進腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，參與腎纖維化的形成［6］。肌成纖維細胞是腎間質(zhì)中合成細胞外基質(zhì)的主要細胞，特異性的表達α-SMA。楊麗霞等研究證實，正常的HK-2細胞不表達α-SMA，而在向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的過程中高度表達α-SMA［7］。因此α-SMA表達的增多是腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的指示性標志物。

尿酸主要經(jīng)腎臟排泄。當尿酸長期在腎小管間質(zhì)內(nèi)沉積，將導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷、激發(fā)炎癥反應(yīng)，最終發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等病變。一些離體實驗研究證實，尿酸可促進人腎小管上皮細胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運子、細胞間黏附分子-1、纖維化相關(guān)因子和基質(zhì)成分的表達［8－10］。

目前腎纖維化細胞模型較少，主要采用TGF－β誘導(dǎo)建立。本研究采用4倍生理濃度尿酸依次進行0.8，0.4倍稀釋，刺激體外培養(yǎng)的 HK-2細胞不同時間（6，12，24，36h），以模擬高尿酸環(huán)境。結(jié)果顯示，尿酸能抑制HK-2細胞活性，通過上調(diào)纖維化相關(guān)因子（TGF-β1、CTGF、α-SMA）的表達，促進HK－2細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。因此，筆者認為采用26mg／dL濃度的尿酸干預(yù)HK-2細胞24h，可以建立腎纖維化的細胞模型。該模型的建立，將對高尿酸血癥導(dǎo)致的腎纖維化的產(chǎn)生機制和藥物的防治研究提供實驗平臺。

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（編輯：張慧茹）

Effect of Uric Acid on Expression of Fibrosis-related Regulatory Factors in HK-2 Cells

CHEN Jicheng，KANG Jie，GAO Bizhen，LIAO Linghong，DING Shanshan

Fujian University of TCM，College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China

ObjectiveTo observe the effect of different concentrations of uric acid（UA）on expression of fibrosis-related regulatory factors in human renal tubular epithelial cells（HK-2），and to establish UA-induced fibrosis model in HK-2cells for study of renal fibrosis diseases.MethodsHK-2cells were exposed to increasing concentrations of UA for 6h，12h，24h，36h，respectively，and the cell viability was determined by MTT assay. Real-Time PCR were employed to investigate the mRNA expression of TGF-β1，CTGF，andα-SMA. The protein levels of TGF-β1，CTGF，andα-SMA were evaluated by immunohistochemistry on HK-2cells exposed to UA for 24h.. ResultsMTT assay showed that UA could induce marked decrease of cell viability in a time-dependent manner as compared with the untreated control cells（P＜0.05）. The mRNA levels of TGF-β1，CTGF andα-SMA were increased time-dependently when HK-2cells were treated with with UA（P＜0.05）. The protein levels of TGF-β1，CTGF and α-SMA were increased significantly in HK-2cells treated with 26mg／dL UA for 24h（P＜0.05）.ConclusionUA could inhibit HK-2cell proliferation and the cells model of renal fibrosis could be established by UA induction.

uric acid；epithelial cells；kidney tubules；fibrosis；immunohistochemistry；polymerase chain reaction

R322.61；R329.24；R341.32；R392.11；R446.1；R589.7

A

1672-4194（2014）01-0025-04

2013-10-27

福建省自然科學(xué)基金（2011J01208），福建省教育廳A類科技重點項目（JA11129）

福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350122

陳繼承（1988－），男，福建中醫(yī)藥大學(xué)2012級碩士研究生

高碧珍.Email：gbz688＠163.com