王 輝，王 春，葛 瑩，李 晨，孔 慧，孔 力

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連116027;2.烏蘭察布市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科，內(nèi)蒙古 集寧012000;3.大連醫(yī)科大學(xué) 組胚實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116044)

鼻腔、鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤(sinonasal inverted papilloma，SNIP)以單側(cè)發(fā)病為主，特征性地發(fā)生于鼻腔后壁中鼻甲區(qū)域和鼻隱窩，有學(xué)者認(rèn)為其可能與胚胎期Schneiderian 膜(外胚層呼吸上皮)不正常異位有關(guān)。SNIP 的組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為幾乎全部是由被覆基底膜完整且明顯增生的非角化鱗狀上皮構(gòu)成，向腫瘤基質(zhì)內(nèi)生長。

廣譜細(xì)胞角蛋白CK，組成細(xì)胞骨架蛋白之一，廣泛存在于人體上皮組織，而不存在于間葉組織中，早在1990年Moll 等［1］的研究報(bào)道，角蛋白分有40種，分為:I 型具有酸性等電點(diǎn)，相對分子量為40 ～56 kb，Ⅱ型具有中性或偏堿性，相對分子量為52 ～67 kb。CK 用于標(biāo)記上皮及上皮來源的腫瘤，亦有用于乳腺癌、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測的報(bào)告，特別是對鑒別和判斷轉(zhuǎn)移性腫瘤是否為上皮源性具有一定的意義。不同文獻(xiàn)報(bào)道SNIP 的復(fù)發(fā)率差別較大，從0% ～78%不等［2］，多為術(shù)后2年，有學(xué)者認(rèn)為其與SNIP“多中心起源”相關(guān)［3］，也有專家認(rèn)為SNIP 切除的徹底性是影響復(fù)發(fā)的主要因素［4-5］。因CK 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中一般保持其亞微結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)特征，角蛋白類型可判斷腫瘤組織學(xué)來源［6］。鼻腔黏膜及多數(shù)腫瘤，主要為鱗狀上皮所覆蓋，有研究指出SNIP 復(fù)發(fā)與瘤體部位和鱗狀上皮增生有關(guān)［7-8］。目前的研究多僅限于鏡下判斷是否陽性，其強(qiáng)度多根據(jù)其范圍、染色深淺用等級表示(如-，+，+ +，+ + +)。SNIP 尚未有利用圖像分析儀計(jì)算具體數(shù)值進(jìn)行陽性表達(dá)程度的比較方法。本研究利用Image-ProPlus 圖像分析儀，測定染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值，探討不同抗原修復(fù)條件對廣譜細(xì)胞角蛋白(CK)陽性表達(dá)程度的影響，篩選優(yōu)勢抗原修復(fù)方法。

1 材料和方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來自2012年9月—2013年5月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受手術(shù)治療且經(jīng)病理證實(shí)的11 例鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者，均無其他合并癥。組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，連續(xù)切片，切片厚度為2. 5 μm。切片所用的載玻片為經(jīng)防脫處理的APES 玻片，60 h烤箱中烤1 ～1.5 h。每例患者的標(biāo)本取連續(xù)切片(4 片)，分為4 組進(jìn)行不同修復(fù)方法，比較其陽性表達(dá)強(qiáng)度。

1.2 免疫組織實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)胞廣譜角蛋白CK 工作液ZM-0069(北京中杉金橋);EDTA 抗原修復(fù)液(稀釋50 倍，pH= 9.0)(北京中杉金橋);PBS 磷酸鹽緩沖液(0.01M pH =7.2 ～7.4)(北京中衫金橋:當(dāng)天配置);SP 試劑盒(北京中山生物);DAB 顯色工作液(北京中山生物)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

全部指標(biāo)均應(yīng)用免疫組織化學(xué)LSAB 法。陰性對照以PBS 代替一抗，皮膚組織切片作為CK 陽性對照。應(yīng)用日本尼康光學(xué)顯微鏡拍攝圖片，Image -Pro Plus 7.0 圖像分析儀。

每張切片取5 個(gè)視野，平均計(jì)算200 個(gè)單位染色區(qū)域面積，測定染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值。實(shí)驗(yàn)過程如下:按實(shí)驗(yàn)修復(fù)條件不同分為4組:(1)高溫高壓EDTA 修復(fù):切片置于高壓鍋中加入EDTA 加熱至121.5 ℃(2 min)，冷卻至室溫;(2)高溫高壓檸檬酸鈉修復(fù):切片置于高壓鍋中加入檸檬酸鈉加熱至121.5 ℃(2 min)，冷卻至室溫。(3)微波EDTA 抗原修復(fù)液，切片置于微波爐加入EDTA 高火3 min，解凍15 min，放置至室溫。(4)微波檸檬酸鈉修復(fù):標(biāo)本置于微波爐加入檸檬酸鈉高火3 min，解凍15 min，放置至室溫。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

如表1所示，SNIP 組織高溫高壓EDTA 修復(fù)CK 陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯優(yōu)于其他3 種修復(fù)方法。應(yīng)用相同的EDTA 修復(fù)液時(shí)，高溫高壓條件陽性表達(dá)強(qiáng)度增高(P ＜0.05)。高溫高壓條件下，EDTA 修復(fù)液(0.01 mmol/L pH=9.0)修復(fù)效果優(yōu)于檸檬酸鈉修復(fù)液(0.01 mmol/L pH =6.0)(P ＜0.05)。免疫組化圖片見圖1～4。

表1 陽性表達(dá)程度平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

表1 陽性表達(dá)程度平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

1)與其他3 種修復(fù)方法比較，P ＜0.05

修復(fù)條件 修復(fù)液平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值高溫高壓EDTA 修復(fù)液 0.365464 ±0.02329881)檸檬酸鈉修復(fù)液 0.323518 ±0.0511906微波EDTA 修復(fù)液 0.324955 ±0.0557229檸檬酸鈉修復(fù)液0.302555 ±0.0614531

3 討 論

免疫組化是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的病理輔助診斷之一，它應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合原理，標(biāo)記的抗體與顯色劑結(jié)合、在組織切片上顯示原位組織細(xì)胞內(nèi)抗原以及抗原的含量與分布，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。

圖1 高溫高壓EDTA 修復(fù)表達(dá)Fig 1 Positive expression of high temperature and pressure EDTA retrieval

圖2 微波EDTA 修復(fù)表達(dá)Fig 2 Positive expression of microwave EDTA retrieval

圖3 高溫高壓檸檬酸鈉修復(fù)表達(dá)Fig 3 Positive expression of high temperature and pressure citrate retrieval

圖4 微波檸檬酸鈉修復(fù)表達(dá)Fig 4 Positive expression of microwave citrate retrieval

Image-Pro Plus 7.0 是由美國Media Cybernetics 生產(chǎn)的全球頂級32 位圖像處理與分析系統(tǒng)軟件，目前應(yīng)用于測量細(xì)胞的核漿比、免疫組織化學(xué)染色圖片分析、DNA 分析、蛋白顆粒分析、相同細(xì)胞不同亞群分析等。以往對免疫組化圖片的分析多采用陽性細(xì)胞百分比聯(lián)合陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分的方式，是半定量的分析方法，人為判定干擾因素較大且組內(nèi)缺乏一定的關(guān)聯(lián)性。后采用灰度值方式表達(dá)，雖然其具有量的概念，但灰度值受染色時(shí)間、顯微鏡照明光源的亮度影響，且與陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。光密度與切片陽性表達(dá)強(qiáng)弱呈正相關(guān)是通過計(jì)算同一標(biāo)本最亮區(qū)域與待測目標(biāo)的平均灰度值的比值，再通過一系列的數(shù)學(xué)公式計(jì)算得來，其不僅具有量的概念，而且大大減小了由于直接測量目標(biāo)區(qū)域所產(chǎn)生的誤差［9］。有研究顯示，傳統(tǒng)半定量描述+、++之間定量數(shù)與灰度值和光密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在這時(shí)陽性區(qū)域強(qiáng)弱定量分析更有意義［10］。

本實(shí)驗(yàn)不僅采取最先進(jìn)的指標(biāo)，在結(jié)果判定部分更加準(zhǔn)確，將隨機(jī)選擇的5 個(gè)視野，應(yīng)用日本尼康顯微鏡(放大400 倍)、CCD 圖像傳感器拍攝免疫組化圖片，調(diào)整為灰階8 位，避免背景著色的干擾，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，對各組免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)光密度(standard optical density，SOD)測定及分析，每張至少取200 個(gè)單位染色區(qū)域面積，取其均值作為SOD 參數(shù)，計(jì)算5 個(gè)視野SOD 的平均值，平均標(biāo)準(zhǔn)光密度代表蛋白的顆粒密度，作為CK 染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均SOD 值。

不同的抗體在不同的修復(fù)條件下，表達(dá)強(qiáng)度不一。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞廣譜角蛋白CK 受抗原修復(fù)條件及修復(fù)液影響較大，根據(jù)患者入院時(shí)間進(jìn)行編序隨機(jī)盲法抽取11 例SNIP 患者病理切片，采用4種不同抗原修復(fù)方法及修復(fù)液。結(jié)果發(fā)現(xiàn):高溫高壓EDTA 修復(fù)液修復(fù)后的CK 陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯優(yōu)于其他3 種修復(fù)方法。

自1991年Shi SR 等［11］認(rèn)為:使用抗原修復(fù)的抗體陽性檢出率及陽性表達(dá)程度明顯高于未修復(fù)者。微波、水浴pH 9.0 T ris -EDTA 熱修復(fù)(水浴或微波)的切片，其表達(dá)效果優(yōu)于pH 6.0 的檸檬酸鹽緩沖液，陽性信號強(qiáng)，定位準(zhǔn)確，背景清晰。修復(fù)液主要有:蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖液、EDTA。目前抗原修復(fù)一般采用:電爐、微波爐加熱，高壓鍋加熱及微波爐加熱。不同的抗體，其最佳的抗原修復(fù)方法和抗原修復(fù)液不盡相同，可能與抗原暴露、修復(fù)的原理不同、各種抗體對各種修復(fù)液的敏感性不一致，并且與修復(fù)時(shí)間及溫度密切相關(guān)。微波熱修復(fù)是利用微波緩沖液的離子或極性分子高速運(yùn)動(dòng)的直接碰撞和高溫條件使醛-氨基、抗原與其他分子間的交聯(lián)或由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)折疊成的三維結(jié)構(gòu)因水解而斷裂，暴露出被掩蓋的抗原決定簇［12-13］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同修復(fù)條件及修復(fù)液對廣譜細(xì)胞角蛋白CK 的陽性表達(dá)程度的影響，本實(shí)驗(yàn)通過利用先進(jìn)的圖像分析儀從數(shù)值上更加準(zhǔn)確地證明:應(yīng)用高溫高壓EDTA 修復(fù)液，可優(yōu)化CK 抗原修復(fù)效果。

對于不同抗體，合理選擇抗原修復(fù)方法是一個(gè)需要在實(shí)際操作過程中反復(fù)摸索而不斷完善的過程，其主要目的是提高難以檢測到的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的抗原檢測率和染色強(qiáng)度，為病理診斷提供準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的參考依據(jù)，為臨床工作做出更好的指導(dǎo)作用。

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