楊春杰，丁　武，馬利杰（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

多級溶劑萃取-氣相色譜測定羊奶中致膻游離脂肪酸

楊春杰，丁武*，馬利杰
（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

目的：建立了多級溶劑萃取-氣相色譜測定羊奶中致膻游離脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸）的方法。方法：樣品經(jīng)過氯仿-甲醇（2∶1，v/v）溶液、碳酸鈉堿性溶液多級溶劑萃取濃縮，并經(jīng)三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w）酯化后，用配備氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜測定。結(jié)果：己酸、辛酸、癸酸的線性范圍分別為5.11～163.52、5.05～161.73和7.54～241.38mg/L，決定系數(shù)R2均大于0.998；三種游離脂肪酸的檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內(nèi)；加標(biāo)回收率分別為88.5%、91.9%和103.4%，方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～6.09%。結(jié)論：本方法經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于液態(tài)奶產(chǎn)品中這幾種游離脂肪酸的檢測。

多級溶劑萃取，甲酯化，氣相色譜，游離脂肪酸，羊奶

羊奶營養(yǎng)價(jià)值豐富，全世界年產(chǎn)量達(dá)2200多萬噸，但是大部分消費(fèi)者不適應(yīng)其存在的獨(dú)特風(fēng)味—膻味，限制了羊奶業(yè)消費(fèi)人群的發(fā)展[1-3]。羊奶中含有3%左右的脂質(zhì)（主要是甘油三酯），游離脂肪酸（FFA）含量少，穩(wěn)定性較差[4]。羊奶中的游離脂肪酸，特別是游離己酸、辛酸和癸酸對膻味的形成起顯著作用[5]，這些游離脂肪酸的含量超過一定濃度，這種膻味就會加強(qiáng)[6]。因此，這幾種游離脂肪酸的檢測對羊奶膻味的研究與控制十分重要。

國際上一直沒有奶中游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)測定方法，目前常用的分析方法是氣相色譜法，如固相萃取-氣相色譜[7-11]、固相微萃取-氣相色譜[12-14]和毛細(xì)管電泳[15]等。固相萃取-氣相色譜對萃取柱、洗脫液選擇要求較高；固相微萃取-氣相色譜的檢測對象是密封奶樣的頂空平衡氣，未能準(zhǔn)確反映奶樣中FFA含量，特別是長鏈不揮發(fā)游離脂肪酸的含量。同時(shí)，這兩種方法大都需要配備專門的萃取設(shè)備，且萃取柱專一性強(qiáng)、易損耗、價(jià)格偏高。毛細(xì)管電泳法雖然步驟簡單，但檢測限偏高。多級溶劑萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜測定游離脂肪酸的方法簡單、經(jīng)濟(jì)，目前該方法只是在酒類，如黃酒、啤酒游離脂肪酸的檢測中有所應(yīng)用[16-17]，同時(shí)相關(guān)研究未對萃取溶劑做進(jìn)一步優(yōu)化選擇。本研究擬采用優(yōu)化的多級溶劑萃取出游離脂肪酸，然后用氣相色譜定量測定這三種游離脂肪酸，以期建立一種簡單、經(jīng)濟(jì)的液態(tài)奶產(chǎn)品中游離脂肪酸的檢測方法，為奶產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)特別是羊奶膻味控制研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羊奶取自西北農(nóng)林科技大學(xué)西農(nóng)薩能奶山羊原種場畜牧基地，經(jīng)65℃下殺菌30min后于4℃密封貯藏；己酸（C6∶0，純度≥99.5%）、辛酸（C8∶0，純度≥99.5%）、癸酸（C10∶0，純度≥99.5%）和壬酸（C9∶0，內(nèi)標(biāo)，純度≥99.5%）標(biāo)準(zhǔn)品阿拉丁公司；三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w） 德國CNW公司；正己烷（色譜純） 阿拉丁公司；氯仿、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、碳酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉均為市售分析純；水雙蒸水。

GC-2014C氣相色譜儀配有FID檢測器日本島津公司；BT25S分析電子天平德國Sartorius公司；旋口玻璃管美國Hach公司；移液槍10～100μL、100～1000μL，德國Eppendorf公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備準(zhǔn)確稱取壬酸20.00mg，用無水乙醇定容至100mL，配制成200.00mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2工作標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液準(zhǔn)確稱取己酸50.00mg、辛酸50.00mg、癸酸75.00mg于一旋口玻璃管，加入三氟化硼甲醇溶液2mL，80℃水浴酯化20min，冷卻后加入1mL飽和氯化鈉溶液，2mL正己烷萃取5次，收集有機(jī)相并用正己烷定容至25mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)母液；準(zhǔn)確稱取壬酸（內(nèi)標(biāo)）50.00mg置于一旋口玻璃管，如上述酯化、萃取處理后定容至25mL，得到2000.00mg/L的內(nèi)標(biāo)母液；分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)母液25、50、100、200、300、400、500、600、700和800μL，各加入500μL的內(nèi)標(biāo)母液，正己烷定容至10mL，得到一系列不同濃度混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按濃度從小到大依次編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。以上標(biāo)準(zhǔn)溶液于-40℃密封保存，使用時(shí)稀釋配制。

1.2.3色譜條件色譜柱：DB-17石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；檢測器：FID；載氣：高純氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度：260℃；檢測器溫度：280℃；色譜柱升溫程序：初始溫度120℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持15min；柱前壓（載氣N2為100kPa，H2為75kPa，空氣為50kPa）；進(jìn)樣量：2μL；分流比為1∶5。

1.2.4樣品制備取10mL羊奶置于50mL旋口離心管，加入500μL內(nèi)標(biāo)溶液、2g NaCl，混勻后加入1mL 2.5mol/L的H2SO4溶液。用25mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）連續(xù)萃取兩次，每次1.5h，收集有機(jī)相。有機(jī)相用5mL 50g/L的Na2CO3溶液連續(xù)萃取3次，收集水相。水相用5mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，然后用5mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）連續(xù)萃取3次，收集有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉脫水后移入旋口玻璃管。氮吹濃縮到約0.5mL，加入1mL三氟化硼甲醇（14%，w/w）溶液，密封后于80℃水浴酯化20min。冷卻后加入1mL飽和NaCl溶液、1mL正己烷，收集有機(jī)相至進(jìn)樣瓶待分析。

1.2.5樣品的測定和計(jì)算根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)相對質(zhì)量校正因子進(jìn)行定量。樣品中各游離脂肪酸含量計(jì)算公式：

式中：ci：樣品中游離脂肪酸i的含量（mg/L）；Ai：樣品中游離脂肪酸i的峰面積；As：樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；fsi：相對質(zhì)量校正因子；cs：樣品中內(nèi)標(biāo)物的含量（mg/L）。

2　結(jié)果與分析

2.1萃取溶劑的選擇

常用的脂類萃取溶劑有乙醚-石油醚[7，18]、正己烷-二氯甲烷[16]、氯仿-甲醇[19]。本研究參照相關(guān)研究選定四種溶劑組合：正己烷-二氯甲烷（2∶1，v/v）、乙醚-石油醚（1∶1，v/v）、乙醚-正己烷（1∶1，v/v）、氯仿-甲醇（2∶1，v/v），比較其對游離己酸、辛酸和癸酸的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷-二氯甲烷和氯仿-甲醇溶劑組合對羊奶中這三種游離脂肪酸的提取效果較好（見圖1）。正己烷-二氯甲烷在萃取過程容易乳化，分層不明顯，使得平行組之間偏差較大，氯仿-甲醇能提取出結(jié)合態(tài)脂類，對游離己酸的提取效率高，萃取過程不易乳化[20]，因此選擇氯仿-甲醇（2∶1，v/v）為萃取溶劑。

圖1　不同萃取溶劑的提取效果Fig.1　Extraction efficiency of different solvents

2.2脂肪酸甲酯萃取過程有機(jī)溶劑的選擇

脂肪酸甲酯常用的萃取溶劑有正己烷、氯仿，本研究比較了這兩種溶劑對所測脂肪酸甲酯的提取效果。正己烷、氯仿對這三種脂肪酸甲酯的提取效果差異不明顯，但是氯仿組在色譜測定時(shí)溶劑有拖尾現(xiàn)象（見圖2），這可能和氯仿具有一定能力的吸水性相關(guān)，水分還會對實(shí)驗(yàn)所用色譜柱有一定的損害作用。因此，選定正己烷（色譜級）作為萃取脂肪酸甲酯的有機(jī)溶劑。

2.3方法的專屬性

羊奶樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液脂肪酸甲酯的保留時(shí)間一致，各脂肪酸甲酯的分離效果良好，雖然己酸甲酯主峰前后有色譜峰出現(xiàn)，但與主峰能實(shí)現(xiàn)基線分離，羊奶樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)及其它雜質(zhì)不干擾樣品的分離測定。該方法在羊奶樣品中還能檢測到另外9種游離脂肪酸（見圖3）。

表1　線性關(guān)系和檢出限分析Table 1　Linear relationship and detection limit of the three kinds of free fatty acids

圖2　正己烷（A）和氯仿（B）萃取脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2　Chromatograms of FAMEs extracted by hexane（A）and chloroform（B）

2.4線性關(guān)系及檢出限

取配好的混和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，由低向高濃度連續(xù)進(jìn)樣。以分析物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

取混和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（標(biāo)號1）分別進(jìn)行系列梯度稀釋測定，以信噪比（S/N）為3時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度計(jì)算檢出限，信噪比（S/N）為10時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度計(jì)算定量限。

在測定濃度圍內(nèi)，F(xiàn)ID響應(yīng)值與被測組分的線性關(guān)系良好，決定系數(shù)均在0.998以上；三種游離脂肪酸的檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內(nèi)（見表1）。

2.5回收率

空白奶樣分別加入三個(gè)不同濃度的己酸、辛酸、癸酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（加標(biāo)量見表2），每個(gè)濃度做3個(gè)平行，同時(shí)做6個(gè)空白奶樣（標(biāo)號1#、2#、3#、4#、5#、6#）。按確定方法進(jìn)行處理、測定。根據(jù)實(shí)際加標(biāo)量和測定加標(biāo)量計(jì)算回收率。

圖3　標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）和奶樣（B）的色譜圖Fig.3　Chromatograms of standards（A）and goat milk（B）

己酸的平均回收率為88.5%，RSD＜5.00%；辛酸的平均回收率為91.9%，RSD＜6.00%；癸酸的平均回收率為103.4%，RSD＜6.50%，表明在所選擇的方法和條件下，三種游離脂肪酸在所選加標(biāo)濃度下均有較高且穩(wěn)定的回收率（見表2）。

表2　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Recovery of the three kinds of free fatty acids

2.6方法重復(fù)性

表3　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 3　Repeatability of the three kinds of free fatty acids

按確定方法處理測定6個(gè)平行空白奶樣（1#、2#、3#、4#、5#、6#），計(jì)算各游離脂肪酸濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。己酸、辛酸濃度的RSD＜5.00%，癸酸濃度的RSD＜7.00%，表明該方法重復(fù)性較好（見表3）。

2.7日內(nèi)日間精密度

取高中低3種濃度的混和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（混標(biāo)液2、6、10），在1d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次。連續(xù)測定5d，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。各峰面積日內(nèi)RSD＜5.00%，日間RSD＜6.00%，表明建立的氣相色譜分析方法穩(wěn)定可靠（見表4）。2.8脂肪酸衍生產(chǎn)物（脂肪酸甲酯）溶液穩(wěn)定性

表4　精密度分析Table 4　Precision of intra-day and inter-day assay

將一份奶樣按確定方法制備好后（奶樣5#），在常溫下0、4、8、12h進(jìn)樣測定，然后-40℃下保存，1～5d內(nèi)每天測定一次，根據(jù)各脂肪酸甲酯對應(yīng)的峰面積變化評價(jià)其穩(wěn)定性。各脂肪酸甲酯的日內(nèi)RSD及日間RSD均小于10%，表明所測各游離脂肪酸預(yù)處理后的衍生產(chǎn)物（脂肪酸甲酯）樣品在常溫下保存12h，-40℃下密封保存5d仍保持穩(wěn)定，均未發(fā)生明顯的變化（見表5）。

2.9樣品測定

采用本方法對羊奶和單菌種在相同發(fā)酵條件下制得的酸羊奶共6個(gè)樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，發(fā)酵后的羊奶中，游離己酸、辛酸、癸酸明顯增加，這和Guler Z，Regula A等的研究相符[7，9]，但各乳酸菌發(fā)酵后的酸羊奶膻味均有不同程度的減弱，可能是發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醛、雙乙酰（丁二酮）等有益風(fēng)味物質(zhì)對膻味起了一定的掩蔽作用。另外，不同乳酸菌對三種游離脂肪酸含量的影響存在差異（見表6）。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了測定羊奶中游離己酸、辛酸、癸酸的多級溶劑萃取-氣相色譜方法。該方法對分析與羊奶中與膻味密切相關(guān)的游離己酸、辛酸、癸酸的專屬性好，檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內(nèi)，重復(fù)性好（RSD均小于10%），回收率在88.5%～103.4%范圍，適用于對液態(tài)奶產(chǎn)品中這三種游離脂肪酸的分析。本方法還檢測到其他9種游離脂肪酸，但對這些脂肪酸的定量檢測適用性還待進(jìn)一步研究。

表6　樣品中游離脂肪酸檢測結(jié)果Table 6　Determination results of the FFAs in the samples

[1]Gerosa S，Skoet J.Milk availability：trends in production and demand and medium-term outlook[EB/OL].United Nations，F(xiàn)AO，（2012-02）[2013-08].www.fao.org/docrep/015/an450e/an450e00.pdf.

[2]楊琴，蔡雷江，孫宗奇，等.薩能奶山羊乳的營養(yǎng)特性及酸羊奶產(chǎn)品開發(fā)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：116-119.

[3]Raynal-Ljutovac K，Lagriffoul G，Paccard P，et al.Composition of goat and sheep milk products：An update[J].Small Ruminant Research，2008，79（1）：57-72.

[4]Strzalkowska N，Jozwik A，Bagnicka E，et al.Chemical composition，physical traits and fatty acid profile of goat milk as related to the stage of lactation[J].Animal Science Papers and Reports，2009，27（4）：311-320.

[5]Skjevdal T.Flavour of goat’s milk：A review of studies on the sources of its variations[J].Livestock Production Science，1979，6（4）：397-405.

[6]Chilliard Y，F(xiàn)erlay A，Rouel J，et al.A review of nutritional and physiological factors affecting goat milk lipid synthesis and lipolysis[J].Journal of Dairy Science，2003，86（5）：1751-1770.

[7]Guler Z，Gursoy-Balcl A C.Evaluation of volatile compounds and free fatty acids in set types yogurts made of ewes’，goats’milk and their mixture using two different commercial starter cultures during refrigerated storage[J].Food Chemistry，2011，127（3）：1065-1071.

[8]Delgado F J，Gonzalez-Crespo J，Cava R，et al.Free fatty acids and oxidative changes of a raw goat milk cheese through maturation[J].Journal of Food Science，2011，76（4）：669-673.

[9]Regula A.Free fatty acid profiles of fermented beverages made from ewe’s milk[J].EDP Sciences，2007，87（1）：71-77.

[10]Mallatou H，Pappa E，Massouras T.Changes in free fatty acids during ripening of Teleme cheese made with ewes’，goats’，cows’or amixture of ewes’and goats’milk[J].International Dairy Journal，2003，13（2-3）：211-219.

[11]Jong C D，Bandings H T.Determination of free fatty acids in milk and cheese procedures for extraction，clean up，and capillary gas chromatographic analysis[J].Journal of High Resolution Chromatography，1990，13（2）：94-98.

[12]Gonzalez-Cordova A F，Vallejo-Cordoba B.Quantitative determination of short-chain free fatty acids in milk using solidphase microextraction and gas chromatography[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（10）：4603-4608.

[13]Pereira R N，Martins R C，Vicente A A.Goat milk free fatty acid characterization during conventional and ohmic heating pasteurization[J].Journal of Dairy Science，2008，91（8）：2925-2937.

[14]孟憲鐘，董志勇.氣相色譜法測定羊奶中致膻成分C6C8C10游離脂肪酸[J].食品科學(xué)，1985，6（9）：39-41.

[15]Vallejo-Cordoba B，Mazorra-Manzano M A，Gonzalez-Cordova A F.Determination of short-chain free fatty acids in lipolyzed milk fat by capillary electrophoresis[J].Journal of Capillary Electrophor，1998，5（3-4）：111-114.

[16]吳春，曹鈺，蔡國林，等.多級溶劑萃取-氣相色譜法測定黃酒中的游離脂肪酸[J].食品工業(yè)科技，2009，30（12）：372-375.

[17]劉春風(fēng)，鄭飛云，李永仙，等.多級溶劑萃取-氣相色譜法測定啤酒中的游離脂肪酸[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2008，27（2）：26-29.

[18]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.27-2010嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[19]Spaepen M，Van Oevelen D，Verachtert H.Fatty acids and esters produced during the spontaneous fermentation of lambic and gueuze[J].Journal of the Institute of Brewing，1978，84（5）：278-282.

[20]Taylor G T，Kirsop B H.Rapid methods for the analysis of the fatty acids of fermenting wort and beer（C6-C10）and yeast（C6-C18）[J].Journal of the Institute of Brewing，1977，83（2）：97-99.

Determination of the free fatty acids responsible for goaty flavor using multilevel solvent extraction-gas chromatography

YANG Chun-jie，DING Wu*，MA Li-jie
（College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

Objective：A method for the simultaneous determination of the free fatty acids（FFA）in goat milk such as caproic acid，caprylic acid and decanoic acid，which were responsible for goaty flavor，was developed by multilevel solvent extraction-gas chromatography.Methods：Extractions were carried out with chloroform/ methanol（2∶1，v/v）and sodium carbonate solution.The fatty acid methyl esters（FAMEs）which were obtained by the esterification of the FFA with boron trifluoride-methanol solution was qualified and quantified by gas chromatography equipped with flame ionization detector.Results：Over the concentration in the range of 5.11～163.52mg/L for caproic acid，5.05～161.73mg/L for caprylic acid and 7.54～241.38mg/L for decanoic acid，the coefficients of the calibration curves were above 0.998.The limits of detection（LOD）were 0.16mg/L for caproic acid，0.19mg/L for caprylic acid and 0.25mg/L for decanoic acid.The limits of quantification（LOQ）were 0.54mg/L for caproic acid，0.63mg/L for caprylic acid and 0.83mg/L for decanoic acid.The average recoveries of the three kinds of FFA ranged from 88.5%to 103.4%with relative standard deviations（RSDs）between 1.98%and 6.09%.Conclusion：The method was economical，accurate，and sensitive，which may be used for determination of the FFAs in milk.

solvent extraction；methylation；gas chromatography；free fatty acid；goat milk

TS252.7

A

1002-0306（2014）14-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.005

2013－10－09*通訊聯(lián)系人

楊春杰（1985-），男，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工和食品安全。

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（3-45）。