陳書明

（三門峽職業(yè)技術學院 食品園林學院，河南 三門峽 472000）

技術與應用

液固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究

陳書明

（三門峽職業(yè)技術學院 食品園林學院，河南 三門峽 472000）

利用蘋果渣為原料，通過炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的液固態(tài)混合發(fā)酵，制備蘋果渣多酶蛋白飼料。 研究表 明 ：液 體 培 養(yǎng) 的 重 要 參 數(shù) 是 溫 度 28℃ 、 接 種 量 12%、 蔗 糖 添 加 量 15g、 轉 速 180r/m in， 時 間 72h；液 體 培 養(yǎng) 產(chǎn) 物 短 期 儲藏，10℃效益高，長期儲藏，2℃～5℃效果好；固體發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件是：接種量 10%～14%，培養(yǎng)時間為 5～6d。 發(fā)酵產(chǎn)物 中 粗 蛋 白 、真 蛋 白 質 量 分 數(shù) 分 別 提 高 了 103.1%、165.76%， 粗 纖 維 、 還 原 糖 則 降 低 了 42.51%、53.62%， 纖 維 素 酶 活 力 增加 了 3000U/g，果 膠酶活 力增 加了 50000U/g。 該方 法生 產(chǎn)的飼 料蛋 白符合 企業(yè) 植物發(fā) 酵蛋 白質飼 料標 準。

液固態(tài)發(fā)酵；蘋果渣；蛋白飼料

蘋果渣是蘋果汁加工業(yè)的副產(chǎn)物，有高度的可生物降解性，會導致腐爛發(fā)臭的味道，影響水資源和生態(tài)系統(tǒng)，因此需要尋找合理的資源化利用途徑。 研究發(fā)現(xiàn)以蘋果渣為主要基質原料，采用固態(tài)發(fā)酵技術可較大幅度地提高物料蛋白質含量。但人們多致力于提高蘋果渣的蛋白質含量，很少涉及抗營養(yǎng)因子的降解與低分子糖類的轉化；其次，存在如菌體生長較慢，種子培養(yǎng)基用量大，發(fā)酵時間長等問題，很難進行規(guī)?；a(chǎn)。

本文采用兩株高產(chǎn)酶菌株對蘋果渣進行液固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)多酶蛋白飼料，對生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化，對纖維素的生物降解、蛋白質和酶含量的提高水平等進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘋果渣：河南緣份果業(yè)有限公司；炭黑曲霉（編號：41254）、產(chǎn)朊假絲酵母（編號：31923）購于中國工業(yè)菌種保藏管理中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白飼料的制備

（1）黑曲霉的擴培：

①活化：將保存的黑曲霉接到馬鈴薯培養(yǎng)基的搖瓶中，100-120r/min、28℃培養(yǎng)。

②一級擴培：將活化后的菌液畫線到改良馬丁瓊脂斜面上，28℃培養(yǎng)靜置培養(yǎng)。

③二級擴培：取一級擴培時典型菌落接種到培養(yǎng)基中，28℃，120r/min 培養(yǎng)。

二級擴培培養(yǎng)基：蛋白胨 3.0g；干果渣 5g，磷酸氫 二 鉀 1.0g； 酵 母 浸 出 粉 2.0g； 氯 化 鈣 0.5g； 葡 萄 糖20.0g；H2O1L。

（2）產(chǎn)朊假絲酵母的擴培：

①菌種活化：將保存的產(chǎn)朊假絲酵母接種到50Be'麥芽汁培養(yǎng)基中，90r/min，30℃培養(yǎng) 4d。

②擴培培養(yǎng)： 活化后的菌種接種到 YPD 培養(yǎng)基上，90r/min，30℃培養(yǎng)。

（3）液體培養(yǎng)（此階段為炭黑曲霉與穿軟假絲酵母的混合培養(yǎng)）：

把菌體調(diào)成濃度為 2×108/L， 按照 5%-10%的接種量接入。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：干蘋果渣 25g，蔗糖 10-20g，蛋白胨 3g，CaCl20.5g，酵母浸出粉 2.0g，KH2PO41g。 水1000mL。 90-180r/m，24-32℃培養(yǎng) 4d。

（4）固體發(fā)酵：

干 蘋 果 渣 500g， 麩 皮 100g， 尿 素 10g，KH2PO410g，水 700ml。 分 裝 于 4 個 5L 的 錐 形 瓶 中 。每個瓶中加（3）培養(yǎng)后的 60、100、140ml菌液，24℃培養(yǎng) 6d。

固體發(fā)酵結束，把發(fā)酵產(chǎn)物 50℃干燥至恒重。

1.2.2 生長曲線繪制：

（1）炭黑曲霉生長曲線

將裝有 50ml培養(yǎng)液的試管封口后置于振蕩培養(yǎng)箱中，在 28℃，90r/min 條件下培養(yǎng)，每 4h 取樣一次，共培養(yǎng) 36h。 將樣品試管培養(yǎng)物抽濾，然后將培養(yǎng)物附帶濾紙 （濾紙在抽濾前進行稱量， 質量標記為 m′）一起置于烘 箱中 105℃干燥置恒重，最 后用電子天平對其進行稱量，質量標記為 m。 黑曲霉菌絲的干重M按照公式：

M=m-m′，計算。 以培養(yǎng)時間為橫坐標，炭黑曲霉的干重為縱坐標繪制炭黑曲霉的生長曲線（圖 1）。

（2）產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線 在擴增培養(yǎng)時，每 3h 取樣一次，共取樣 8 次，測定其在 600nm 下的吸光值，繪制種子生長曲線（圖 2）。本試驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。 將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。

1.2.3 菌體和孢子計數(shù)：

根據(jù)菌體生長曲線，選擇對數(shù)生長期的菌種進行菌落計數(shù)。方法是將擴培結束的炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)過梯度稀釋，通過稀釋平板菌落計數(shù)法檢測菌活數(shù)。

1.2.4 正交試驗設計

選取影響菌體生長的重要因素即溫度、接種量、轉速、蔗糖添加量 4 個因素，各取 3 個水平，測定液體培養(yǎng)過程中菌體數(shù)量，進行 L9（34）正交設計試驗，正交設計因素和水平見表 1。

表1 液體培養(yǎng)的正交設計因素和水平

1.3 干飼料的理化測定：

粗 蛋 白 的 測 定 采 用 雙 縮 脲 法[1]。

真 蛋 白 的 測 定 采 用 改 進 的 微 量 凱 氏 定 氮 法[2]。稱取固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物 5g，用 40mL 體積分數(shù) 75%的乙醇浸提 24h，充分攪 拌、抽濾，濾渣 再 用 40mL 體積分數(shù) 75%的乙醇反復洗滌 2 次，以洗去無機氮和尿素，同時沉淀蛋白質。 將沉淀物于 60℃下干燥至恒量，再用微量凱氏定氮法測定。

還原糖含量的測定 沸煮 30min，過濾，重復 3次，合并濾液，再用費林法對溶液測定。

粗 纖 維 含 量 的 測 定 采 用 過 濾 法[3]。

灰 分 含 量 的 測 定 用[4]。

纖維素酶活力測定采用 3，5-二硝基水 楊 酸 法[5]。

果 膠 酶 活 力 采 用 黏 度 法[6]。

2 試驗結果與分析

2.1 種子生長曲線

由圖 1 可知，在 0-8h，炭黑曲霉干重增加緩慢，這說明該階段為孢子的萌發(fā)期，8-16h，干重迅速增加，之后干重值變化趨于平坦，這說明 8-16h 為炭黑曲霉的對數(shù)生長期，16-36h 為穩(wěn)定期。 在發(fā)酵過程中，為縮短菌體的適應時間，選擇炭黑曲霉菌體繁殖最快，菌體最強壯的對數(shù)生長期末期的菌體進行液體培養(yǎng)接種。

圖1 炭黑曲霉生長曲線

由圖 2可知， 產(chǎn)朊假絲酵母在培養(yǎng)的最初 6h生長緩慢， 之后到 12h 這段時間生長迅速，12-24h這段時間菌液的吸光度幾乎沒有變化。這說明在培養(yǎng)的前 5h是菌體的適應階段， 之后進入快速生長階段，是菌體的對數(shù)期生長期，此后，菌體進入穩(wěn)定期和衰亡期，但是由于由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯，另外，如果菌體衰亡的特別多，菌體會破裂，這時吸光度值會減小的，因此說明該階段可能只是菌體的穩(wěn)定期，檢測沒有進行到衰亡期。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線

2.2 培養(yǎng)條件對液體培養(yǎng)期菌種生長的影響

2.2.1 正交試驗結果與分析

在表1所確定的主要影響因素和水平的基礎上，按 L9（34）正交表進行正交試驗，測定培養(yǎng)液中菌體數(shù)量。 正交數(shù)據(jù)分析結果見表2。

表2 液體培養(yǎng)的正交試驗結果和直觀分析表

從表 2 的 R 值可知，A＞D＞C＞B， 對菌體數(shù)量影響最大的因素是溫度，其次是蔗糖量，接種量相對較小 ，轉 速 影 響 最 小 。 最 優(yōu) 水 平 組 合 結 果 為 A2B2C3D2。而這個最優(yōu)水平組合在正交試驗過程中是沒有進行的，因此需要進一步的驗證。 在進行驗證試驗時，只對影響菌體數(shù)量的主要因素進行驗證，轉速作為影響最小的因素，不再驗證。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

根據(jù)正交試驗結果，設定菌體的培養(yǎng)溫度為26、28、30℃，接種量取 10%，蔗糖量取 15g，轉 速 取180_r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進行取樣，通過平板菌落計數(shù)。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

圖 3 顯示，在 26、28℃培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)的菌體數(shù)量增加，總體呈上升趨勢。 30℃條件下，開始的前 72h 菌體數(shù)量呈上升趨勢，但是，隨著培養(yǎng)時間的延長菌體數(shù)量呈下降趨勢，96h 檢測時與 72h 相比，下降近 7%。 這可能是由于剛開始時由于各種營養(yǎng)物質充足，在適度較高的情況下有利于菌體的繁殖，后來隨培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液內(nèi)積累了大量的菌體，但此時培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質因逐漸消耗而不能滿足所有菌體的需要，從而導致一部分菌體的死亡。 在培養(yǎng)的 96_h內(nèi)，28℃較 26℃能培養(yǎng)更多數(shù)量的菌體， 所以最適的液體培養(yǎng)溫度是 28℃。

2.2.3 接種量對菌 體生長的影響

根據(jù)正交試驗結果，設定菌體的接種量設為8%、10%、12%，培養(yǎng)溫度為 28℃，蔗糖量取 15g，轉速取 180r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進行取樣，通過平板菌落計數(shù)。

圖4 接種量對菌體生長的影響

接種量的多少直接影響到菌種的生長速度。接種量小培養(yǎng)時間就要延長，由于目的菌群數(shù)量不足還容易感染雜菌，同時菌絲體容易抱團生長導致團中心缺氧而導致菌體數(shù)量增長緩慢；接種量大，如果培養(yǎng)時間過長將會導致菌體產(chǎn)生較多的有害物質，對菌體的生長是不利的。

由圖 4 可知，8%、10%的接種量使液體培養(yǎng)時的菌體數(shù)量在培養(yǎng)的 96小時內(nèi)呈增加趨勢， 在接種后的 72h 內(nèi)，12%的在接種后 72h 呈增加趨勢，之后呈下降趨勢。 8%的接種量雖然整體呈增加趨勢，但總量低于 10%，可能的原因是炭黑曲霉再生長過程中由于接種量小而抱團生長，再培養(yǎng)基內(nèi)溶氧量不高的情況下菌團中間的菌體很難獲得足夠的氧氣而導致整體的菌體數(shù)量增加不多。 10%的接種量菌絲體呈分散狀生長，菌體缺氧現(xiàn)象不明顯。12%的也呈分散狀生長， 但是由于后期液體發(fā)粘，溶氧量下降， 導致在 72-96h 的這段時間內(nèi)有部分菌體因缺氧而死亡。

在培養(yǎng)的 96h 內(nèi)，接種量為 8%、10%、12%三者中，12%的接種量培養(yǎng) 72h 時菌體數(shù)目最多， 說明最好的接種量為 12%，培養(yǎng)時間是 72h。

2.2.4 蔗糖添加量對菌體生長的影響

根據(jù)正交試驗結果，設定菌體的蔗糖添加量設為 13、15、17，培 養(yǎng) 溫 度 為 28℃，接 種 量 取 12%，轉速取 180r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進行取樣，通過平板菌落計數(shù)。

圖5 蔗糖添加量對菌體生長的影響

圖 5 顯示，在培養(yǎng)的前 72h，添加 13、15、17g 蔗糖對菌體數(shù)量影響不明顯，在 72-96h，添加 17g 的菌體數(shù)量多于 13、15g 的， 并且培養(yǎng)基中添加 13、15g 的 ，菌 體數(shù) 量 有 所下 降 ，17g 的菌 體 數(shù) 量 變 化 不明顯。 這表明培養(yǎng)基中添加 17g蔗糖效果最好。

2.3 存儲條件對液體培養(yǎng)產(chǎn)物的影響

把炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母液體混合培養(yǎng)后，所得的菌體與培養(yǎng)基的液體混合物將作為進一步蘋果汁固體發(fā)酵的發(fā)酵劑。 在實際生產(chǎn)中，發(fā)酵劑制備好后通常需要存儲和流通后被使用，因此研究存儲條件對發(fā)酵劑的有效使用是非常必要的。

因為剛制備好的發(fā)酵劑中的菌處于生理活性很旺的狀態(tài)，要使發(fā)酵劑能長期保存，必須使菌體生理活性降低而又不死亡，其中溫度是關鍵。 設定儲藏溫度分別為 2℃、5℃、10℃， 保藏 7、14、30d 后用平板菌落計數(shù)法測定菌體數(shù)量（發(fā)酵劑制備后迅速降溫至設定溫度進行試驗）。

圖6 存儲條件對菌體的影響

由圖 6 可知，在 2、5℃的條件下，發(fā)酵劑內(nèi)菌體數(shù)量變化趨勢不明顯，10℃的條件下， 菌體數(shù)量變化呈下降趨勢。 在存儲的前 14d，10℃與 2、5℃的菌體數(shù)量差異不大，之后 10℃的明顯低于 2、5℃的。這說明 10℃條件下適合短期存儲，2、5℃的條件適合長期存儲，考慮到制冷對能耗的消耗，長期存儲在5℃下是最合適的。

2.4 固體發(fā)酵條件的確定

接種量的減少意味著生產(chǎn)便利和發(fā)酵產(chǎn)量的增加，應該在允許的范圍內(nèi)盡可能降低接種量。 但太少的接種量會使發(fā)酵時間延長，蛋白質量分數(shù)降低，同時發(fā)揮不了菌種優(yōu)勢，容易感染其他雜菌，產(chǎn)生異味，影響產(chǎn)物品質。

圖7 接種量和發(fā)酵時間對粗蛋白含量的影響

圖 7 顯示，隨著接種量的加大，粗蛋白含量呈遞增趨勢；隨培養(yǎng)時間的延長，粗蛋白含量也呈遞增趨勢；接 100m l發(fā)酵劑與接 140ml發(fā)酵劑在培養(yǎng) 6d 的情況下粗蛋白質量分數(shù)相差不大，接 60m l發(fā)酵劑在培養(yǎng)時粗蛋白質量分數(shù)與 100、140 相比差異較大。由此可知，接 100m l或 140ml發(fā)酵劑是比較適合。

發(fā)酵時間對生產(chǎn)至關重要，時間短，達不到理想的蛋白質量分數(shù)，而太長，則生產(chǎn)周期與成本增加。圖7顯示底物粗蛋白質量分數(shù)的動態(tài)變化。即隨發(fā)酵的進行，粗蛋白質量分數(shù)均迅速上升。 在接種量為 100、140ml的情況 下 ， 發(fā) 酵 的 4d 與 5d 相比，粗蛋白的質量分數(shù)顯著增加，發(fā)酵 5d 與 6d 差異不顯著。 綜合考慮發(fā)酵時間、接種量、成本等多種因素，當接種量為 100ml時，發(fā) 酵 6d 效果較 好，接種量 140m l時，發(fā)酵 5d 效果較好。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物主要成分測定和分析

對發(fā)酵原料和產(chǎn)物進行主要成分測定，結果如表 3 所示。 由結果可知：以蘋果渣為主要原料，經(jīng)液固態(tài)混合發(fā)酵后，產(chǎn)物的主要成分發(fā)生明顯變化。粗 蛋 白 、 真 蛋 白 質 量 分 數(shù) 分 別 提 高 了 103.1% 、165.76%，粗纖維、還原糖則 降低了 42.51%、53.62%，纖維素酶活力增加了 3000U/g， 果膠酶活力增加了50000U/g。 蛋白質含量符合福建科佳奇邁生物工程有限公司的植物發(fā)酵蛋白質飼料標準[7]。

S816.4

：B

：1671-9123（2014）03-0106-04

2013-07-07

三門峽職業(yè)技術學院橫向合作項目（SZY-2013-019）

陳書明（1980-），女，河南許昌人，三門峽職業(yè)技術學院食品園林學院講師。