丁建英，周永濤，汪嘉栩，陳文飛，陳夢琳（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

聚硫堇修飾的有機磷農(nóng)藥生物傳感器的研制

丁建英，周永濤，汪嘉栩，陳文飛，陳夢琳
（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

研制了一種用于蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留快速檢測的電化學酶傳感器。通過循環(huán)伏安法將電子媒介體硫堇電聚合在玻碳電極上作為電子傳遞體，用殼聚糖凝膠將乙酰膽堿酯酶固定于聚硫堇電極表面，制成了新型的有機磷農(nóng)藥生物傳感器。結(jié)果表明在有機磷農(nóng)藥樂果濃度為0.1～60μg/mL范圍內(nèi)，酶電極抑制率（%）與樂果的濃度（C）的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9961，檢出限以抑制率10%的農(nóng)藥濃度計算為0.05μg/mL。

酶傳感器，硫堇，有機磷農(nóng)藥，玻碳電極，乙酰膽堿酯酶

有機磷農(nóng)藥因其高效、低殘留在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用，但由此帶來的環(huán)境污染日趨嚴重，同時農(nóng)產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥的殘留對人體健康產(chǎn)生危害。我國的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)始于20世紀50年代，近年來取得了重要進展。目前，檢測農(nóng)產(chǎn)品中有機磷殘留的國標方法主要為氣相色譜法[1]，優(yōu)點是準確，靈敏，但是設(shè)備昂貴，費時費力。為了達到快速篩查有機磷農(nóng)藥污染蔬菜，我國出臺了蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留快速檢測標準，即GB-T 5009.199-2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測》，該法是基于酶抑制原理的速測卡法和分光光度法，其特點為檢測較為迅速，但易受樣品本底顏色的干擾，且準確性偏低。電化學酶生物傳感器由于制作簡單、具有使用方便、靈敏、快捷等優(yōu)點，因此在醫(yī)學[2]、環(huán)境[3]、食品[4]等領(lǐng)域有較多的研究應(yīng)用。目前也有一些文獻報導(dǎo)相關(guān)有機磷農(nóng)藥生物傳感器的研究[5-8]，但尚無基于電子介體硫堇的有機磷農(nóng)藥生物傳感器的報道。

硫堇是一種吩噻嗪類染料，具有電子傳遞作用，在電化學酶傳感器中有較多的研究應(yīng)用，可提高電極的靈敏度、穩(wěn)定性[9-12]。

本文首次將硫堇聚合于玻碳電極表面，用殼聚糖溶膠凝膠將膽堿酯酶固定聚硫堇電極表面，研制了乙酰膽堿酯酶生物傳感器用于有機磷農(nóng)藥殘留的檢測，該傳感器具有良好的穩(wěn)定性、靈敏度，該酶電極具有制備簡單，使用方便，將該傳感器用于蔬菜樣品中有機磷農(nóng)藥留的快速檢測顯示出較好的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙酰膽堿酯酶AChE 500U/mg，Sigma公司；氯化硫代乙酰膽堿ATCh Sigma公司；碳納米管 深圳碳納米港有限公司；殼聚糖 浙江金殼生物有限公司；樂果 上海析友分析儀器有限公司；其他試劑均為分析純試劑；實驗用水 均為二次蒸餾水。

CHI660C電化學工作站 上海辰華儀器公司；超聲波清洗器 上海聲析超聲儀器有限公司；旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；玻碳電極、飽和甘汞電極、Pt電極 上海辰華儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玻碳電極的預(yù)處理 將玻碳電極（GC，直徑為4mm）分別用Al2O3拋光粉拋光至鏡面，然后分別在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗各3min。用氮氣吹開后備用。

1.2.2 硫堇的電聚合 將預(yù)處理好的玻碳電極參照文獻[13]的方法置于5mmol·L-1硫堇醋酸緩沖溶液（pH=4.5）中，在-0.4～0.3V電壓范圍內(nèi)以0.05V·s-1的速率循環(huán)掃描50圈形成聚硫堇膜。聚合后的電極用二次蒸餾水沖洗后放在pH=7.0的PBS緩沖溶液內(nèi)保存。

1.2.3 酶電極的制備 用移液槍吸取80μL殼聚糖溶液（0.3g殼聚糖溶于10mL 1%的乙酸溶液）與20μL乙酰膽堿酯酶溶液（0.5mg乙酰膽堿酯酶溶解于1mL的0.01mol/L PBS溶液）混合均勻，用微量注射器吸取8μL滴加到備用的電極上，置于4℃冰箱10～12h，待滴于電極上的混合物干燥后備用。

1.2.4 電化學分析方法 采用三電極體系，用循環(huán)伏安法對酶電極制備過程及特性進行了表征；工作電位0.7V、室溫（25±1）℃，在磷酸緩沖液中（磁力攪拌下），用計時電流法研究酶電極的的催化性能，檢測條件的優(yōu)化，并根據(jù)酶電極在0.21mg/mL的底物ATCH中的響應(yīng)電流I1，酶電極在不同濃度樂果溶液中浸泡15min后對0.21mg/mL的ATCH的響應(yīng)電流I2，計算各種濃度農(nóng)藥相對應(yīng)的抑制率，抑制率計算公式[14]為：

2 結(jié)果與討論

2.1 酶電極的電化學表征

2.1.1 酶傳感器的循環(huán)伏安特性 在5mL 0.1mol·L-1pH為7.0的磷酸緩沖溶液（PBS）中，采用循環(huán)伏安法研究電極的電化學特性。圖1顯示了玻碳電極在聚合硫堇前后在PBS中的循環(huán)伏安曲線，圖1（a）為裸電極在PBS溶液中的循環(huán)伏安圖像，沒有出現(xiàn)明顯的氧化-還原峰，圖1（b）為聚硫堇電極在PBS中的循環(huán)伏安圖像，有明顯的氧化-還原峰，說明了硫堇成功聚合在電極表面，并形成了良好的導(dǎo)電膜，且能發(fā)生良好可逆反應(yīng)。圖2為酶電極在0.1mol·L-1pH為7的PBS溶液中的循環(huán)伏安（CV）曲線。圖2（a）為聚硫堇電極表面修飾殼聚糖凝膠和乙酰膽堿酯酶混合物后制備成的酶電極在PBS溶液中的CV圖，圖2（b）為測試底液中加入乙酰膽堿酯酶的催化底物氯化硫代乙酰膽堿（0.21mg/mL）后的CV圖，從圖2（b）中可以看出，在電位0.7V左右出現(xiàn)了明顯的氧化峰，說明修飾在電極表面的乙酰膽堿酯酶對底物氯化硫代乙酰膽堿有明顯的電催化作用。圖2（c）為酶電極在有機磷農(nóng)藥樂果（1.0μg/mL）溶液中浸泡15min后，在含氯化硫代乙酰膽堿的PBS溶液中的CV圖，在電位0.7V處氧化電流明顯減小，表明在經(jīng)過有機磷農(nóng)藥樂果浸泡后對酶電極表面乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生了抑制作用。

圖1 不同修飾電極在PBS中的CV圖Fig.1 Cyclic voltammograms of different electrodes

圖2 酶電極在PBS緩沖液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of enzyme electrodes in PBS buffer

2.1.2 酶傳感器對底物的催化 本實驗研究了酶電極對底物溶液（ATCH）的計時電流響應(yīng)情況，工作電位0.7V、室溫（25±1）℃，在5mL pH為7.0的0.1mol/L磷酸緩沖液中（磁力攪拌的環(huán)境下），每次加入30μL（12mg/mL）氯化硫代乙酰膽堿，由圖3可知，隨著測試底液中底物ATCH不斷加入，酶電極的催化響應(yīng)電流也不斷變大，顯示了經(jīng)乙酰膽堿酯酶修飾的電極對底物具有良好的響應(yīng)性能，圖4顯示酶電極響應(yīng)電流隨著底物ATCH濃度的增加，響應(yīng)電流增大，當?shù)孜锏牧?.23mg/mL以后，響應(yīng)電流的接近恒定，不再明顯變化，說明此時修飾于電極上的乙酰膽堿酯酶已催化作用達最大，在ATCH濃度為0.2～0.5mg/mL時，酶電極對底物的電流響應(yīng)最為靈敏，本實驗選擇0.21mg/mL的底物濃度進行檢測條件的優(yōu)化實驗及抑制實驗。

圖3 酶電極對不同濃度ATCH的電流-時間響應(yīng)曲線Fig.3 Enzyme electrode response to i-t curve of ACTH

圖4 響應(yīng)電流與底物ACTH濃度的關(guān)系Fig.4 Current relationship with the concentration of ACTH

2.2 酶傳感器檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 pH的影響 酶電極檢測體系溶液中的pH對酶電極表面酶的催化活性的影響很大，因為酶在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出較好的催化活性。在某一pH時，酶的催化活性會達到最高，此時的pH為最適pH，一般最適pH在中性（pH=7）左右波動。本實驗由于將酶修飾于電極表面后酶催化的微環(huán)境發(fā)生了變化，其催化的最適pH也可能發(fā)生變化。本實驗考察了酶電極在pH為6.0～9.0范圍的0.1mol/L磷酸緩沖液中對0.21mg/mL ACTH的響應(yīng)電流（圖5）。實驗發(fā)現(xiàn)，酶電極在pH為8.0時酶電極對0.21mg/mL的氯化硫代乙酰膽堿催化時的響應(yīng)電流最大，且在pH超過8.0后，響應(yīng)電流逐漸下降，這是由于溶液的堿性過大，影響了乙酰膽堿酯酶的活性。故后續(xù)的實驗中以pH為8.0的磷酸緩沖溶液為測試底液。

圖5 pH對酶電極響應(yīng)的影響Fig.5 Effect of pH on the enzyme electrode response

2.2.2 溫度的影響 溫度是影響酶電極催化反應(yīng)的另一個重要因素。而且酶的活性也與溫度有著直接關(guān)系，溫度升高，酶的催化反應(yīng)速度加快，但溫度過高會使酶蛋白變性而失活。一般情況下酶的活性在37℃左右最強。本實驗中，在含ACTH濃度為0.21mg/mL的pH=8的0.1mol/L磷酸緩沖溶液中，10～40℃范圍內(nèi)考察了酶電極對0.216mg/mL底物標準溶液響應(yīng)的影響（圖6）。實驗表明，隨著溫度升高，響應(yīng)電流不斷增大，當達到30℃時，電極響應(yīng)電流值達到最大，說明此時酶的活性最大，催化速率最高，進一步升高溫度時可能部分酶變性而失活，酶的活性開始下降導(dǎo)致了催化電流的下降。但是實際過程中，考慮到電極表面硫堇的穩(wěn)定性、酶電極的靈敏度和實際使用中的便捷性，且在25℃時酶電極的響應(yīng)電流較大，因此測定時底液溫度選擇為25℃。

圖6 溫度對酶電極響應(yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the enzyme electrode response

2.2.3 抑制時間的選擇 酶電極在有機磷農(nóng)藥中抑制的時間長短對固定在其上的乙酰膽堿酯酶活性有著重要影響，測試體系為含ACTH濃度為0.21mg/mL的pH8.0的0.1mol/L PBS溶液。如圖7所示，1.0μg/mL的樂果對乙酰膽堿酯酶的抑制作用隨著時間的延長抑制率逐漸增大，在抑制時間5～15min時抑制率隨著時間的延長迅速增加，在15min抑制率達高峰，而在20min時抑制率無明顯上升，因此在抑制率曲線的制作過程中選擇15min作為最佳抑制時間。

圖7 抑制時間的優(yōu)化Fig.7 Optimization of suppression time

2.3 有機磷農(nóng)藥對酶傳感器的抑制率曲線及實際樣品的測定

2.3.1 有機磷農(nóng)藥的抑制率曲線 將樂果（40%乳油）按照一定比例稀釋制成梯度濃度的溶液，用本文方法制成的酶電極在最優(yōu)化條件下用電流-時間曲線測定有機磷農(nóng)藥樂果對酶電極的抑制率。測試底液為含ACTH濃度為0.21mg/mL的5mL pH8.0的0.1mol/L PBS溶液。由于有機磷農(nóng)藥對AChE有抑制作用，經(jīng)過抑制后的酶電極在0.21mg/mL氯化硫代乙酰膽堿溶液中產(chǎn)生的催化電流明顯比抑制前有明顯降低，電流減小的程度與農(nóng)藥的濃度有一定的比例關(guān)系。以抑制率對農(nóng)藥濃度的對數(shù)作圖，結(jié)果表明，農(nóng)藥對AChE的抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)在樂果溶液0.1～ 60μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見圖8），抑制率與有機磷農(nóng)藥樂果濃度的對數(shù)的線性關(guān)系方程為：抑制率（%）=42.29+24.85logC，相關(guān)系數(shù)R=0.9961，參考文獻[15]將抑制率為10%時對應(yīng)的農(nóng)藥濃度作為檢出限，其最低檢出限為0.05μg/mL，最低檢出限遠低于該農(nóng)藥的國家最高殘留限量標準，說明酶電極具有較好的準確性和靈敏度。

Fabrication of organophosphorus pesticide biosensor modified by polythionine

DING Jian-ying，ZHOU Yong-tao，WANG Jia-xu，CHEN Wen-fei，CHEN Meng-lin
（College of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

An amperometric biosensor for the detection of organophosphorus pesticides in vegetables was developed.This novel bienzyme electode biosensor was fabricated with acetylcholinesterase（ACHE）immobilized by chitosansilica on the surface of the polythionine modified glassy carbon electrode.Under optimal experimental conditions.The inhibition rate versus the logarithm of dimethoate concentration was linear over the range of 0.1μg/mL to 60μg/mL with the linear correlation coefficient of 0.9961.The detection limitation for dimethoate，calculated by inhibition rate of 10%，was 0.05μg/mL.

enzyme biosensors；thionine；organophosphorus pesticides；acetylcholinesterase

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0074-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.006

2013－09－11

丁建英（1967-），女，碩士研究生，副教授，研究方向：食品品質(zhì)控制。