段一娜，楊佳琪，王 晶，高亞賢

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

穿山龍水溶性總皂苷對RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9的影響

段一娜，楊佳琪，王 晶，高亞賢

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

目的:觀察穿山龍水溶性總皂苷對大鼠滑膜成纖維細(xì)胞系RSC-364細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的影響。方法:應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素17(IL-17)刺激RSC-364細(xì)胞建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型，并以不同劑量穿山龍水溶性總皂苷進(jìn)行干預(yù)，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-2和MMP-9的水平。結(jié)果:穿山龍水溶性總皂苷各劑量組(10、20、30mg/L)在不同時間點(24、48、72h)均可明顯降低TNF-α和IL-17刺激的RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9水平的升高，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。結(jié)論:穿山龍水溶性總皂苷可能通過抑制RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

穿山龍水溶性總皂苷;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;基質(zhì)金屬蛋白酶-9

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是臨床常見的慢性炎性自身免疫性疾病，以滑膜增生、骨侵蝕和多關(guān)節(jié)炎癥為基本特征，RA的致殘率較高，是造成勞動力喪失的主要病因之一[1]?；ぱ装Y伴大量血管翳形成是導(dǎo)致RA骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞的主要原因。RA進(jìn)展過程中，異常的血管新生是滑膜增生和血管翳形成的病理基礎(chǔ)。調(diào)節(jié)血管新生的因素很多，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)以及基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)的激活等，其中MMPs的激活對調(diào)節(jié)血管翳的形成具有重要作用[2-3]。

穿山龍是民間常用的治療RA的中藥，主要成分是穿山龍水溶性總皂苷，但其治療RA的作用機(jī)制不明，相關(guān)研究報道較少。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，穿山龍總皂苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平具有顯著的抑制作用[4]。本研究擬從細(xì)胞水平觀察穿山龍水溶性總皂苷對RA血管翳形成的關(guān)鍵因子-MMPs分泌的影響，進(jìn)一步闡明其治療RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364(河北醫(yī)科大學(xué)惠贈)，薯蕷皂苷片(主要成分為穿山龍水溶性總皂苷，西安東盛制藥廠，批號H20003743)，研磨、溶于細(xì)胞培養(yǎng)液過濾除菌，-4℃冰箱保存，實驗時以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。胎牛血清、DMEM(美國Sigma公司)，大鼠MMP-2、MMP-9 ELISA試劑盒(美國PEPROTECH公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364 40℃水浴復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種于一次性培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，傳代2次后選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 加藥干預(yù):RSC-364細(xì)胞消化后制成2×104/ ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2ml。實驗分為空白對照組、模型組、穿山龍總皂苷(10、20、30mg/L)組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿6孔板的80%后，除空白對照組外，其余各組加入TNF-α(10μg/L)和IL-17(10μg/L)共同孵育，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，穿山龍總皂苷組分別加入10、20、30mg/L的穿山龍總皂苷水溶液;分別于干預(yù)后24、48、72h收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，置-80℃保存。

1.3 檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-2和MMP-9的含量 采用ELISA檢測，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀450nm處檢測A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件行重復(fù)測量的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍水溶性總皂苷對RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2的影響 TNF-α+IL-17刺激后，模型組各時間點RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2的水平明顯高于空白組(P＜0.05);穿山龍總皂苷3個劑量組各時間點RSC-364細(xì)胞分泌MMP-2的水平均明顯低于模型組，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。見附表。

2.2 穿山龍水溶性總皂苷對RSC-364細(xì)胞分泌MMP-9的影響 TNF-α+IL-17刺激后，模型組各時間點RSC-364細(xì)胞分泌MMP-9的水平明顯高于空白組(P＜0.05);穿山龍總皂苷3個劑量組各時間點RSC-364細(xì)胞分泌MMP-9的水平均明顯低于模型組，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。見附表。

附表 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9的含量±s)

附表 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9的含量±s)

與空白組同時間點比較:*P＜0.05;與模型組同時間點比較:△P＜0.05

組 別 MMP-2(ng/ml) MMP-9(ng/ml) 24h 48h 72h 24h 48h 72h空白組 0.258±0.016 0.267±0.018 0.265±0.013 0.309±0.085 0.321±0.082 0.298±0.034模型組 0.782±0.044* 0.795±0.048* 0.798±0.052* 0.679±0.112*1.281±0.099* 1.387±0.023*穿山龍 10 0.342±0.012*△ 0.325±0.023△ 0.344±0.017△ 0.405±0.052△0.397±0.052△0.342±0.073△總皂苷 20 0.337±0.014*△ 0.308±0.021△ 0.339±0.027△ 0.384±0.087△0.378±0.074△0.318±0.087△組(mg/L) 30 0.296±0.021*△ 0.272±0.018△ 0.297±0.009△ 0.344±0.031△0.328±0.095△0.305±0.041△

3 討論

RA是一種常見的慢性自身免疫性疾病，病理學(xué)基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥病變，病理學(xué)特征是滑膜上皮層出現(xiàn)過度增生，上皮下層大量炎性細(xì)胞浸潤伴有微血管新生、血管翳形成以及對骨組織和軟骨的侵蝕破壞。抑制滑膜新生血管形成，阻止血管翳的生長和進(jìn)一步對軟骨和骨的破壞，可能是治療RA的一種重要方法[5]。Paleolog的研究證實，MMPs是參與血管翳形成及對軟骨侵蝕破壞的重要細(xì)胞因子[6]。

MMPs是一種分解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的鋅蛋白酶[7]。正常生理狀態(tài)下，MMPs與其天然抑制劑TIMPs保持動態(tài)平衡，維持機(jī)體組織的降解和更新修復(fù)。RA時，炎性因子的刺激可導(dǎo)致MMPs表達(dá)升高，引發(fā)軟骨基質(zhì)崩解，MMPs對ECM的降解是RA患者關(guān)節(jié)破壞的必要環(huán)節(jié)[8]。MMP-2又稱為明膠酶-A，可降低ECM中Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅺ型膠原和蛋白多糖、粘連蛋白、纖維結(jié)合素等的含量，加快ECM的降解。MMP-9又稱為明膠酶-B，能降解微血管基底膜及間質(zhì)成分，可為管腔形成和血管內(nèi)皮遷移清除基質(zhì)屏障，是血管新生、血管翳形成的重要前提條件。因此，MMP-2、MMP-9在RA中可能起著重要作用，抑制二者的過度表達(dá)可能控制RA病情的發(fā)展[9]。

本研究觀察了穿山龍水溶性總皂苷對調(diào)節(jié)RA滑膜血管新生的重要因子MMP-9和參與ECM降解的因子MMP-2分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿山龍水溶性總皂苷干預(yù)可明顯抑制RA滑膜細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9，且呈明顯的劑量依賴性。本研究表明，穿山龍水溶性總皂苷可通過抑制RA滑膜細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9，達(dá)到抑制血管新生、減慢血管翳形成的作用，從而減輕MMP-2和MMP-9過度分泌對關(guān)節(jié)軟骨及骨的降解侵蝕作用，發(fā)揮對RA的治療作用，因此提示，穿山龍水溶性總皂苷可能具有抗RA的潛在價值。

[1]古正濤，沈鷹.NF-κB對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病作用的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(9):1576-1578.

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[4]董文娟，梁秀軍，翟澤玲，等.穿山龍總皂苷對CIA大鼠滑膜血管新生的作用[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，27(4):360-362.

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EFFECTS OF WATER SOLUBLE TOTAL SAPONINS OF DIOSCOREA NIPPONICA ON RSC-364 CELLS SECRETING MMP-2 AND MMP-9

DUAN Yi-na, YANG Ja-qi, WANG Jing, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To observe the inf l uence of water soluble total saponins of Dioscorea nipponica on rat synovial fi broblast cell line RSC-364 cells secreting matrix metalloproteinases-2 (MMP-2) and MMP-9.Methods:Interleukin-17 (IL-17) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were used to stimulate RSC-364 for establishing rheumatoid arthritis (RA) cell model, then the cell model was intervened by water soluble total saponins of Dioscorea nipponica in different dosage. ELISA was used to detect the MMP-2 and MMP-9 level in cultural supernatants of RSC-364 cells.Results:Water soluble total saponins of Dioscorea nipponica in different dosage at different time point could obviously reduce the level of RSC-364 cells secreting MMP-2 and MMP-9 stimulated by IL-17+ TNF-α, and showed dosage-dependent (P＜0.05).Conclusions:Water soluble total saponins of Dioscorea nipponica may play a role in anti-RA by inhibiting RSC-364 cell secreting MMP-2 and MMP-9.

Water soluble total saponins of Dioscorea nipponica; Rheumatoid arthritis; MMP-2; MMP-9

R966

A

1004-6879(2014)03-0189-03

2013-10-07)