曹一波，于 君，馬 晶，金 晨，馬亞輝，金 緯，丁玉珀，侯英泊

姜黃素對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

曹一波，于 君，馬 晶，金 晨，馬亞輝，金 緯，丁玉珀，侯英泊

目的探討姜黃素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。方法 應(yīng)用CCK-8比色法檢測經(jīng)正常培養(yǎng)液及含不同濃度(25、50、100μmol/L)姜黃素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h后的U87細(xì)胞的存活率;應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗檢測100μmol/L姜黃素對U87細(xì)胞遷移能力的影響;將20只SD大鼠制備成膠質(zhì)瘤模型，隨機分成對照組及實驗1、2、3組，每組5只，模型制備后第7天對照組給予生理鹽水灌胃，實驗1、2、3組分別給予姜黃素100、200、300 mg/kg灌胃，1/d，連續(xù)14 d，第15天用microPET-CT對載瘤大鼠腫瘤體積進(jìn)行測定。結(jié)果 U87細(xì)胞存活率隨著培養(yǎng)液中姜黃素濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長而降低(P＜0.05);給予100μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24和48 h后U87細(xì)胞遷移度均低于空白對照組(P＜0.05);實驗2、3組腫瘤體積均小于實驗1組和對照組(P＜0.05)。結(jié)論 姜黃素可抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖及遷移。

姜黃素;膠質(zhì)瘤;增殖;遷移;大鼠，Sprague-Dawley

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤［1］，因其具有較強的增殖、遷移和侵襲能力，使膠質(zhì)瘤患者的存活時間及存活率降低［2］，現(xiàn)有的治療手段尚未能明顯地改善患者的預(yù)后［3］。目前治療膠質(zhì)瘤研究的主要目標(biāo)是抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及增殖。姜黃素是由植物合成的天然多酚，廣泛存在于多種植物中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有多種生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒、抗真菌以及抗腫瘤的作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)錄因子-κ以及表皮生長因子受體(EGFR)mRNA的表達(dá)起到抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤生成的作用［5］。本實驗重點探討姜黃素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SD雄性大鼠20只，體重280～300 g(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供);CCK-8(Dojindo研究所);U87細(xì)胞系(第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)外科研究所惠贈);胎牛血清(Hyclone公司);姜黃素(Sigma公司);杜伯改良的依格培養(yǎng)基(DMEM，Gibico公司);胰蛋白酶(Gibico公司);microPET-CT(通用公司);酶聯(lián)免疫儀(華東電子管廠)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將U87細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置在飽和濕度、37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測(CCK-8比色法):取對數(shù)生長期U87細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×105個/ml，接種到96孔板中，每孔200μl。正常條件下培養(yǎng)24 h后，處理組分別用含有25、50和100μmol/L的姜黃素培養(yǎng)液培養(yǎng)，空白對照組加入正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組設(shè)5個平行孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入 20μl的 CCK-8溶液(水浴至37℃)，再培養(yǎng)1 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長時的吸光度值。計算不同濃度條件下姜黃素作用24、48及72 h后U87細(xì)胞的存活率。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗:將對數(shù)生長期的U87細(xì)胞傳代，接種在6孔板中，正常培養(yǎng)，在單層細(xì)胞長滿培養(yǎng)板底面積約80%時，用無菌消毒的20μl加液器槍頭均勻做劃痕，用磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗去細(xì)胞碎片，使用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)，處理組培養(yǎng)液含姜黃素濃度為100μmol/L，空白對照組不加姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h，每組設(shè)5個平行孔，在倒置顯微鏡下觀察，測量細(xì)胞遷移的程度，照相記錄，計算遷移度，遷移度(%)=(劃痕時兩側(cè)距離－檢測時兩側(cè)距離)/劃痕時兩側(cè)距離×%。

1.2.4 microPET-CT測量膠質(zhì)瘤模型大鼠腫瘤體積

1.2.4.1 大鼠膠質(zhì)瘤模型的制備:將SD大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，消毒、鋪巾，取內(nèi)眥連線中點向后縱向切開頭皮1 cm，分離充分暴露顱骨。采用Batker法確定右側(cè)尾狀核靶點，于冠狀縫前1 mm、中線右側(cè)旁開3 mm，用牙科鉆鉆孔，直徑為1．2 mm，達(dá)硬腦膜表面，不可傷及腦組織。用25μl微量注射器抽取U87細(xì)胞懸浮液10μl，以1μl/min的速度勻速注入，注射完畢后留針5 min，緩慢退針，醫(yī)用明膠海綿填充骨孔，骨蠟封閉，縫合皮膚［6］。

1.2.4.2 分組及治療方法:將20只膠質(zhì)瘤模型大鼠隨機分成對照組及實驗1、2、3組，每組5只。從模型制備后第7天開始對照組給予生理鹽水灌胃，實驗1、2、3 組分別給予姜黃素 100、200、300 mg/kg灌胃，1/d，連續(xù)14 d。第15天用microPET-CT測量腫瘤體積［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用多因素方差分析，α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素及作用時間對U87細(xì)胞存活率的影響 隨著培養(yǎng)液中姜黃素濃度的增加，U87細(xì)胞的存活率逐漸降低(P＜0.05)，且不同濃度姜黃素組U87細(xì)胞存活率隨時間的延長而降低(P＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度姜黃素及作用時間對U87細(xì)胞存活率的影響(±s，%)

表1 不同濃度姜黃素及作用時間對U87細(xì)胞存活率的影響(±s，%)

注:空白對照組加入正常培養(yǎng)液;與空白對照組比較，a P＜0.05;與25μmol/L姜黃素組比較，c P＜0.05;與50μmol/L姜黃素組比較，e P＜0.05;與本組24 h比較，g P＜0.05;與本組48 h比較，i P＜0.05

24 h 48 h 72 h 100 μmol/L 姜黃素組 5 67．01 ±23．32ace 51．51 ±10．31aceg 27．14 ±6．14組別 孔數(shù)aceig 100．00 ±9．07 100．00 ±16．13 100．00 ±14．29 50 μmol/L 姜黃素組 5 84．37 ±9．40ac 67．93 ±19．13acg 47．52 ±15．07acig 25 μmol/L 姜黃素組 5 95．66 ±9．92a 75．42 ±13．16ag 53．80 ±15．01aig正常對照組5

2.2 100μmol/L姜黃素對U87細(xì)胞遷移度的影響

處理組培養(yǎng)24和48 h后U87細(xì)胞遷移度均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 100μmol/L姜黃素對U87細(xì)胞遷移度的影響(±s，%)

表2 100μmol/L姜黃素對U87細(xì)胞遷移度的影響(±s，%)

注:空白對照組加入正常培養(yǎng)液，處理組加入含100μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液;a P＜0.05

組別 孔數(shù)24 h 48 h處理組 5 1．64 ±0．96a 1．04 ±0．57a 5 3．10 ±0．76 7．38 ±2．93空白對照組

2.3 不同濃度姜黃素對腫瘤體積的影響 對照組及實驗1、2、3組第15天測得腫瘤體積分別為(500.80 ±63.52)、(471.80 ±79.70)、(328.80 ±55.29)和(253.20 ±70.08)mm3。實驗2、3 組腫瘤體積均小于對照組和實驗1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗1組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);實驗2組和實驗3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見腫瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，為惡性程度極高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高增殖能力和耐放療及化療的特點，臨床治療受到極大的限制［8］。近些年植物提取藥物正成為新藥開發(fā)的一種簡捷途徑，姜黃素是一種純天然的多酚類化合物，有關(guān)姜黃素治療膠質(zhì)瘤的研究也有了新的發(fā)現(xiàn)，如姜黃素能通過作用細(xì)胞自噬以及與腫瘤遷移相關(guān)的LN18途徑達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤增生和遷移的目的［9-11］，對多種腫瘤細(xì)胞有明確的毒性作用［12-13］。多項實驗研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過 p53、PTEN、PI3K/Akt、Caspase-3、NF-κB 以及 p65 等分子通路實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長和遷移的作用［14-15］。同時，姜黃素能夠通過水分子通路途徑對創(chuàng)傷后腦水腫起到保護作用［16］，這是其他抗腫瘤藥物所不具有的特征，在腦膠質(zhì)瘤手術(shù)治療前聯(lián)合使用姜黃素可減輕術(shù)后腦水腫。因此，姜黃素可以作為治療膠質(zhì)瘤理想的化療輔助藥物。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素能明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率，隨著培養(yǎng)液中姜黃素濃度的增加，U87細(xì)胞的存活率逐漸降低，且不同濃度姜黃素組U87細(xì)胞存活率隨時間的延長而降低;通過劃痕實驗證實，給予含有100μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24和48 h后細(xì)胞遷移度均低于空白對照組;進(jìn)一步研究顯示，姜黃素能夠抑制載瘤大鼠膠質(zhì)瘤的生長，但無明顯的量效關(guān)系，即隨著給予姜黃素劑量的增加其抑制腫瘤生長的作用無明顯增加，其原因尚未明確。

姜黃素能夠通過多條細(xì)胞通路對腫瘤細(xì)胞生長及遷移起到抑制作用，而對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的遷移及生長抑制作用的確切分子途徑尚不明確?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用，因為這類酶能分解細(xì)胞間基質(zhì)中各種蛋白，破壞組織學(xué)屏障，從而利于腫瘤細(xì)胞的侵襲［17］。因而，抑制瘤細(xì)胞內(nèi)MMPs活性有助于抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及擴散。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過抑制MMPs活性進(jìn)一步起到抑制膠質(zhì)瘤遷移的作用［18］。而其對U87細(xì)胞的存活率以及載瘤大鼠腫瘤生長的抑制作用機制尚不明確，有待進(jìn)一步研究證實。

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Effects of Curcum in on Cell Proliferation and Migration Ability of Glioma U87 Cells

CAO Yi-bo，YU Jun，MA Jing，JIN Chen，MA Ya-hui，JINWei，DING Yu-po，HOU Ying-bo(Department of Neurosurgery，Tianjin Sanatorium of Beijing Military Area command，Tianjin 300381，China)

ObjectiveTo explore the effects of Curcumin on cell proliferation and migration ability of glioma U87 cells．MethodsSurvival rates of glioma U87 cells，cultured by normal culture solutions and different concentrations(25，50 and 100μmol/L)Curcumin solutionwere detected using CCK-8 assay after culturing for24 h，48 h and 72 h;effect of cellmigration by 100μmol/L Curcumin solution was assessed using cell scuffing test;20 Sprague-Dawley(SD)ratswere randomly divided into control group(n=5)and three experimentgroups(group A，group B，group C，each n=5)after establishing gliomamodels．The 7thd after establishingmodels，control group was lavaged with saline solution，and group A，B and Cwas lavaged with 100，200 and 300mg/kg Curcumin solution respectively，(1 time/d)for14 d．Tumor volumesweremeasured on the 15thd usingmicroPET-CTmethod．ResultsSurvival rates of glioma U87 cellswere decreased with elevated Curcumin concentration and lengthened cultivation time(P＜0.05);level of U87 cell migration was lower than that in control group after being cultured with Curcumin solution(100μmol/L)for24 h and 48 h(P＜0.05);tumor volumes in group B and Cwere smaller than those in group A and control group(P＜0.05)．ConclusionCurcuminmay inhibit the cell proliferation and migration in glioma U87 cells．

Curcumin;Glioma;Proliferation;Migration;Rat，Sprague-Dawley

R730;R-332

A

2095-140X(2014)05-0019-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．005

300381天津，北京軍區(qū)天津療養(yǎng)院神經(jīng)外科

2014-01-16 修回時間:2014-02-10)

·論著·