劉丹丹，隋汝波，張 磊，夏海苗，王春檢

卒中后抑郁 (post-stroke depression，PSD)是卒中后常見精神并發(fā)癥之一，可發(fā)生于卒中后的各個(gè)時(shí)期，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和愈后［1-3］。目前該病發(fā)病機(jī)制不明，多種機(jī)制并存。近年來越來越多的證據(jù)表明小腦與認(rèn)知、行為及精神疾病相關(guān)［4-7］。同時(shí)，臨床試驗(yàn)已證實(shí)電刺激小腦頂核能顯著改善PSD患者的抑郁癥狀［8］。小腦可通過廣泛的神經(jīng)通路與其他部位腦組織發(fā)生聯(lián)系是不同精神疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外關(guān)于PSD小腦的研究多集中在影像學(xué)方面，本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)小腦低功能與PSD發(fā)病相關(guān)，于是本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上觀察PSD大鼠小腦形態(tài)學(xué)改變，并觀察小腦浦肯野細(xì)胞凋亡情況，為明確PSD發(fā)病機(jī)制及PSD的臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠72只，均經(jīng)曠野實(shí)驗(yàn) (OFT)評分排除水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分總和低于20分及超過120分的大鼠。體質(zhì)量為250～350 g(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。許可證號:SCXK(遼)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級別:普通級。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(activated-caspase 3)抗體 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司);鏈霉親和素-生物素復(fù)合物 (SABC)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);TUNEL試劑盒 (羅氏公司)。

1.1.3 主要儀器 LEICA-RM2135石蠟切片機(jī)，烘片機(jī)，烤片機(jī)，恒溫水浴箱，BH/CH20BIMF200顯微鏡，CTAS-1000細(xì)胞圖像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，晝夜節(jié)律光照，自由攝食進(jìn)水，通風(fēng)良好， (21±2)℃恒溫。將大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組 (6只)給予假手術(shù)處理，除拴線不插入頸總動(dòng)脈外，余同卒中組;抑郁組 (6只)給予慢性不可預(yù)見的溫和刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng);余60只大鼠行大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)術(shù)，術(shù)后隨機(jī)取神經(jīng)功能評分處于1～4分的大鼠12只，隨機(jī)分為卒中組 (6只)和PSD組 (6只)，PSD組大鼠于MCAO術(shù)后第3天給予CUMS結(jié)合孤養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物模型制備方法

1.2.2.1 大鼠 CUMS 模型 參照 Willner等［9］和 Katz等［10］方法:(1)禁食、禁水20 h;(2)禁水17 h;(3)傾斜鼠籠45℃17 h;(4)持續(xù)光照17 h;(5)濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h;(6)4℃游5 min;(7)水平搖晃5 min;(8)行為限制2 h;(9)夾尾1 min。9種刺激每天隨機(jī)采取1種，共刺激21 d。

1.2.2.2 大鼠MCAO模型［11］腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)將大鼠麻醉完全后，置于手術(shù)臺上，仰臥固定。取頸正中切口，分離、結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈及其分支動(dòng)脈。夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端，通過距離頸總動(dòng)脈分叉處近心端0.5 cm的切口插入經(jīng)肝素處理過的魚線，當(dāng)?shù)竭_(dá)指定長度 (18 mm左右)時(shí)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈并固定魚線。假手術(shù)組除不插入魚線外，其他過程同卒中組。青霉素局部外用后縫合皮膚。術(shù)中及術(shù)后注意大鼠的保溫，尤其是頭部的保溫。大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征被認(rèn)為是模型成功的標(biāo)志。

1.2.2.3 孤養(yǎng) 將抑郁組和PSD組動(dòng)物單籠飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)觀察和測試 CUMS開始第1、7、14、21天測量大鼠體質(zhì)量，并行蔗糖水實(shí)驗(yàn) (禁食禁水20 h后測定大鼠1 h糖水消耗比例，即糖水消耗量/總液體消耗量×100%)和OFT(室內(nèi)隔音，測定5 min水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分)。

1.3.2 標(biāo)本制備 各組大鼠完成行為學(xué)觀察和測試證明造模成功后，用4%多聚甲醛行局部灌流后分離出小腦組織，甲醛外固定，石蠟包埋，制備厚約5 μm的連續(xù)冠狀切片，制備防脫切片〔3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)行防脫處理〕。

1.3.3 尼氏染色 (Nissl染色) 石蠟切片脫蠟至水化→置于1%甲苯胺藍(lán)中，50℃條件下染色20 min→雙蒸水漂洗→分色→梯度乙醇脫水→二甲苯透明→封片。觀察浦肯野細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 測定activated-caspase 3陽性細(xì)胞，按即用型免疫組織化學(xué)試劑盒說明書 (SABC法)操作。常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉;Ⅰ抗:兔抗大鼠activated-caspase 3單克隆抗體 (1∶400);Ⅱ抗:生物素化山羊抗兔IgG;DAB顯色;常規(guī)蘇木素復(fù)染;脫水、透明、封片。用PBS代替Ⅰ抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果作為陰性對照。光鏡下觀察并計(jì)算陽性染色的浦肯野細(xì)胞數(shù)，即activated-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)。每張切片隨機(jī)取目標(biāo)區(qū)域6個(gè)高倍鏡視野 (×400)，測量并記錄每個(gè)視野activated-caspase 3陽性細(xì)胞平均數(shù)。

1.3.5 TUNEL染色 采用TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞。切片常規(guī)脫蠟至水后，3%過氧化氫 (H2O2)室溫封閉后，蛋白酶K于37℃環(huán)境下消化10～15 min，標(biāo)記液37℃標(biāo)記2 h后封閉30 min，生物素化地高辛抗體37℃反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染;脫水、透明、封片。不含末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT)反應(yīng)液的為陰性對照。每張玻片分別隨機(jī)取6個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算浦肯野細(xì)胞凋亡率，凋亡率 (%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 ()表示，符合正態(tài)分布的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 4組大鼠應(yīng)激 (CUMS)后第1天體質(zhì)量、糖水消耗比例、水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);而應(yīng)激后第7(除外體質(zhì)量和水平運(yùn)動(dòng))、14、21天4組大鼠上述指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。組間兩兩比較:應(yīng)激后第14、21天卒中組、抑郁組、PSD組體質(zhì)量和水平運(yùn)動(dòng)低于假手術(shù)組，應(yīng)激后第14、21天抑郁組和PSD組體質(zhì)量、水平運(yùn)動(dòng)低于卒中組;應(yīng)激后第7、14、21天，卒中組、抑郁組、PSD組糖水消耗比例低于假手術(shù)組，應(yīng)激后第14、21天抑郁組、PSD組糖水消耗比例低于卒中組;應(yīng)激后第7天卒中組、PSD組垂直運(yùn)動(dòng)低于假手術(shù)組，應(yīng)激后第14、21天卒中組、抑郁組、PSD組垂直運(yùn)動(dòng)低于假手術(shù)組，應(yīng)激后第14天PSD組垂直運(yùn)動(dòng)低于卒中組，應(yīng)激后第21天抑郁組、PSD組垂直運(yùn)動(dòng)低于卒中組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1～4)。

表1 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠體質(zhì)量比較 (，g)Table 1 Comparison of weight of rats among different groups at different time points after stimulation

表1 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠體質(zhì)量比較 (，g)Table 1 Comparison of weight of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P＜0.01

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天假手術(shù)組 6 231.9 ± 7.1 237.4 ±12.0 290.9 ±5.0 322.7 ± 5.1卒中組 6 235.8 ± 9.5 229.0 ± 5.2 271.0 ±7.8△ 280.2 ± 7.0△抑郁組 6 237.8 ± 5.4 230.9 ± 7.1 258.4 ±3.8△☆ 268.7 ±10.6△▲PSD 組 6 230.1 ±11.4 226.3 ± 5.0 233.9 ±6.0△☆ 232.4 ± 8.1△☆F 0.990 2.179 100.246 131.809 P值值0.417 0.122 0.000 0.000

表2 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠糖水消耗比例比較 (，%)Table 2 Comparison of sugar consumption rate of rats among different groups at different time points after stimulation

表2 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠糖水消耗比例比較 (，%)Table 2 Comparison of sugar consumption rate of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P＜0.01

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天假手術(shù)組 6 81.6 ±7.4 78.8 ±3.7 81.3 ±2.8 85.0 ±8.7卒中組 6 80.3 ±6.0 60.4 ±4.5△ 63.7 ±3.2△ 60.4 ±3.9△抑郁組 6 77.7 ±5.8 63.0 ±4.3△ 58.2 ±5.2△▲ 44.6 ±8.4△☆PSD 組 6 81.7 ±6.1 59.4 ±3.1△ 39.2 ±2.6△☆ 25.4 ±4.1△☆F 值0.665 0.000 0.000 0.000 0.532 31.880 138.043 86.571 P值

表3 應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)比較 (，次/5 min)Table 3 Comparison of horizontal motion of rats among different groups at different time points after stimulation

表3 應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)比較 (，次/5 min)Table 3 Comparison of horizontal motion of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與卒中組比較，☆P＜0.01

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天假手術(shù)組 6 64.6 ±14.1 61.9 ±12.2 61.0 ±5.2 62.9 ±3.1卒中組 6 60.1 ±14.2 52.0 ± 2.8 50.0 ±3.2△ 46.6 ±2.1△抑郁組 6 64.5 ± 9.5 50.3 ±14.5 43.9 ±1.6△☆ 36.5 ±1.1△☆PSD 組 6 61.6 ±13.3 46.8 ± 4.6 38.7 ±3.6△☆ 31.1 ±1.6△☆F 0.179 3.117 42.461 182.313 P值值0.909 0.076 0.000 0.000

表4 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)比較 (，次/5 min)Table 4 Comparison of vertical motion of rats among different groups at different time points after stimulation

表4 應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)比較 (，次/5 min)Table 4 Comparison of vertical motion of rats among different groups at different time points after stimulation

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與卒中組比較，▲P＜0.05，☆P ＜0.01

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天假手術(shù)組 6 19.4 ±6.1 21.3 ±3.4 23.0 ±2.7 24.2 ±4.7卒中組 6 14.7 ±3.2 12.6 ±3.6△ 18.4 ±0.9* 17.8 ±6.5*抑郁組 6 19.6 ±5.3 15.9 ±3.3 16.0 ±4.7△ 11.0 ±3.4△▲PSD 組 6 19.8 ±4.5 8.8 ±8.6△ 7.4 ±4.0△☆ 5.1 ±2.0△☆F 值0.234 0.004 0.000 0.000 1.542 6.126 22.142 20.566 P值

2.2 尼氏染色結(jié)果 假手術(shù)組尼氏體在尼氏染色中清晰可辨，受染后呈塊狀，尼氏體大而數(shù)量多，反映神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng) (見圖1A)。與假手術(shù)組比較，卒中組 (見圖1B)、抑郁組 (見圖1C)及PSD組(見圖1D)均有尼氏體減少甚至消失，表現(xiàn)為尼氏體從核周開始崩解為細(xì)塵狀顆粒，并逐漸向外擴(kuò)展，進(jìn)而完全溶解消失，細(xì)胞質(zhì)著色淺，胞體腫脹。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 大鼠小腦浦肯野細(xì)胞activated-caspase 3抗原的表達(dá):小腦浦肯野細(xì)胞單層排列，呈梨形或燒瓶形，陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于細(xì)胞質(zhì)。假手術(shù)組activated-caspase 3陽性表達(dá)不明顯。各組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞activated-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中卒中組、抑郁組、PSD組高于假手術(shù)組，抑郁組、PSD組又高于卒中組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表5、圖2)。

2.4 TUNEL染色結(jié)果 光鏡下凋亡神經(jīng)元胞核深染為棕黃色，胞體縮小，可見核固縮和核破裂，非凋亡神經(jīng)元胞核則呈藍(lán)色。假手術(shù)組小腦浦肯野細(xì)胞偶可見細(xì)胞凋亡，推測是生理性死亡。各組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中卒中組、抑郁組、PSD組高于假手術(shù)組，抑郁組、PSD組又高于卒中組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表5、圖3)。

3 討論

愈來愈多的研究表明，精神分裂癥、抑郁等精神紊亂與小腦病變有關(guān)，而小腦急性和慢性病變均可引起小腦認(rèn)知情感障礙綜合征［12-14］，且小腦低功能的程度與抑郁的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。既然結(jié)構(gòu)決定功能，故推測PSD作為一種特殊抑郁，其發(fā)病時(shí)小腦存在結(jié)構(gòu)性的病理改變，且這種病理改變與PSD發(fā)病相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立MCAO模型，模擬與PSD發(fā)病相關(guān)的“內(nèi)源性機(jī)制學(xué)說”。待卒中急性期過后，加以CUMS和孤養(yǎng)模擬人類PSD發(fā)病機(jī)制中的社會(huì)應(yīng)激因素。發(fā)現(xiàn)隨著刺激時(shí)間的延長，PSD組大鼠體質(zhì)量、糖水消耗比例 (心境低落，食欲下降)、水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng) (活動(dòng)減少，興趣下降)下降，從剛開始刺激后低于假手術(shù)組到后來低于卒中組，說明大鼠整體精神不振，焦慮，毛色晦暗無光澤，進(jìn)食減少，活動(dòng)減少，不動(dòng)時(shí)間延長，出現(xiàn)抑郁的核心癥狀——情緒低落、興趣缺乏和樂趣缺乏。行為學(xué)觀察和測試結(jié)果證實(shí)成功建立PSD模型。

圖1 各組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞中尼氏小體的表達(dá) (Nissl雜色，×400)Figure 1 Expression of Nissl bodies in cerebellar Purkinje cells in each group

圖2 各組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞中activated-caspase 3的表達(dá) (SABC法，×400)Figure 2 Expression of activated-caspase 3 in cerebellar Purkinje cells in each group

圖3 各組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞凋亡情況 (TUNEL雜色，×400)Figure 3 The apoptotic changes in cerebellar Purkinje cells in each group

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受到傷害后為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬、紋狀體、大腦和小腦皮質(zhì)對缺血較敏感，缺血后易發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元的損傷，而在小腦皮質(zhì)各神經(jīng)元中尤以蒲肯野細(xì)胞最為敏感［15］。近期國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)PSD大鼠海馬和杏仁核區(qū)域凋亡細(xì)胞增加［16-17］，而關(guān)于小腦區(qū)域是否存在神經(jīng)元的凋亡壞死還不明了。腦缺血后細(xì)胞主要通過死亡受體途徑［18-19］、線粒體途徑［20-21］及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［22］途徑發(fā)生凋亡壞死。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員，屬于凋亡執(zhí)行蛋白類，多種凋亡相關(guān)蛋白級聯(lián)反應(yīng)通過caspase 3引發(fā)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組、卒中組比較，PSD組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞胞體腫脹，尼氏小體數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)著色淺，反映蛋白質(zhì)合成功能下降;凋亡相關(guān)蛋白actived-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)和小腦浦肯野細(xì)胞凋亡率增加。以上結(jié)果提示PSD大鼠小腦浦肯野細(xì)胞凋亡增加，且這種改變與半胱氨酸蛋白酶依賴的凋亡途徑相關(guān)。

表5 各組大鼠浦肯野細(xì)胞activated-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)及凋亡率比較()Table 5 Comparison of activated-caspase 3 positive cells and apoptosis rate of cerebellar Purkinje cells in each group

表5 各組大鼠浦肯野細(xì)胞activated-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù)及凋亡率比較()Table 5 Comparison of activated-caspase 3 positive cells and apoptosis rate of cerebellar Purkinje cells in each group

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與卒中組比較，△P＜0.01

組別 只數(shù) activated-caspase 3陽性細(xì)胞數(shù) 凋亡率(%)假手術(shù)組 6 0.7 ±0.3 3.9 ±0.3卒中組 6 4.5 ±0.8* 22.9 ±1.6*抑郁組 6 6.0±1.0＊△ 27.4±1.8＊△PSD 組 6 7.3 ±0.9＊△ 38.9±4.7＊△F 值0.000 0.000 71.762 181.219 P值

小腦皮質(zhì)可以參與感覺和運(yùn)動(dòng)信息的加工處理。蒲肯野細(xì)胞是小腦皮質(zhì)發(fā)出的惟一能夠傳出沖動(dòng)的神經(jīng)元，其軸突止于小腦的深部核團(tuán) (齒狀核和頂核)，接受傳入小腦的全部沖動(dòng)?，F(xiàn)已證實(shí)浦肯野細(xì)胞能通過釋放γ-氨基丁酸 (GABA)抑制小腦深部核團(tuán)的活動(dòng)［23］。PSD大鼠小腦浦肯野細(xì)胞在發(fā)生凋亡壞死后對深部核團(tuán)的抑制作用減弱，可反射性地引起炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，這與學(xué)者提出的PSD發(fā)病的細(xì)胞因子假說相符［24］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示電刺激小腦頂核細(xì)胞能改善浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，Sui等［25］在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上提出小腦低功能可能參與PSD發(fā)病的假說，以上均提示小腦損傷與PSD發(fā)病相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSD大鼠小腦形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，小腦浦肯野細(xì)胞凋亡增加，且這種改變與PSD發(fā)病相關(guān)，為明確PSD的發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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