萬宇平，羅曉琴，郝小妹，崔廷婷，黃寶兵，朱亮亮

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.大同市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西大同037004）

動(dòng)物組織中賽庚啶競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的建立

萬宇平1，羅曉琴1，郝小妹1，崔廷婷1，黃寶兵2，朱亮亮1

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.大同市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西大同037004）

建立快速檢測(cè)動(dòng)物組織中賽庚啶的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法。制備賽庚啶人工抗原作為包被原，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體，構(gòu)建快速檢測(cè)動(dòng)物組織中賽庚啶的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法。結(jié)果表明，Logit/Log擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-2.051 8X-1.353 4，相關(guān)系數(shù)R為0.995 7，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.23 μg/L，動(dòng)物組織樣本的檢測(cè)限為0.3 μg/kg，賽庚啶陽性樣本的加標(biāo)回收率為85.1%～114.5%，樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)為5.2%～9.6%。建立的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附方法具有較好的特異性、回收率和重復(fù)穩(wěn)定性，可用于動(dòng)物組織中賽庚啶殘留的檢測(cè)。

動(dòng)物組織；賽庚啶；競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫

賽庚啶（cyproheptadine）是一種抗組胺藥，具有抗膽堿能和鎮(zhèn)靜作用，可用于治療各種過敏性疾病，也可用于改善患者食欲[1-3]。近幾年在國內(nèi)某些飼料產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)添加[4]，可能是為了通過刺激食欲來提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度以達(dá)到增加體質(zhì)量的目的。但食用含有賽庚啶殘留的動(dòng)物源性產(chǎn)品會(huì)對(duì)人體造成不利影響，對(duì)兒童的作用更為明顯，高濃度可直接引發(fā)昏迷、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀，嚴(yán)重者則直接導(dǎo)致死亡[4-5]。因此，我國農(nóng)業(yè)部第1519號(hào)公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》清單。目前已有關(guān)于飼料、尿樣及藥劑中賽庚啶檢測(cè)方法的報(bào)道，主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-12]。但該方法不適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣本的快速檢測(cè)。因此，有必要建立動(dòng)物源性食品及其相關(guān)產(chǎn)品中賽庚啶殘留的測(cè)定方法。本研究結(jié)合實(shí)際工作需要，建立了競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）快速測(cè)定動(dòng)物組織中的賽庚啶，該方法較為靈敏、操作步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，非常適合中小企業(yè)、基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、豬肝等樣本：超市；賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、去甲基賽庚啶（純度≥99%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（優(yōu)級(jí)純）、N,N-二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）（純度≥99%）、碳化二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）（純度≥99%）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（純度≥99%）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）：美國Sigma公司；醛基活化的辣根過氧化物酶：美國Thermo公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純；賽庚啶單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為北京勤邦生物技術(shù)有限公司制備保存。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；SH-400A均質(zhì)器：上海禾工科學(xué)儀器有限公司；AUY220精密電子天平：日本島津公司；THZ-103B振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LD-3離心機(jī)：江蘇同君儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 賽庚啶半抗原合成

稱取0.55 g去甲基賽庚啶和1 mL吡啶溶于10 mL DMSO中，制成A液；稱取0.39 g溴乙酸叔丁酯溶于5 mL DMSO后于40℃條件下緩慢滴入A液中，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)4 h，蒸除溶劑；簡(jiǎn)單柱層析分離后，除去溶劑，加入20 mL DMSO和5 mL甲酸，室溫條件下反應(yīng)20 h，蒸除溶劑，乙醇-水體系中重結(jié)晶得到羧基賽庚啶，即為目標(biāo)半抗原。

1.3.2 賽庚啶全抗原合成

全抗原合成采用活潑酯法，將半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被抗原，具體操作過程：取20 mg賽庚啶半抗原溶于1 mL DMF中，取30 mg EDC和NHS用0.2 mL去離子水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫條件下攪拌反應(yīng)24 h，得到B液；取50 mg OVA充分溶解于3.8 mL檸檬酸鹽緩沖液（citrate buffer，CB）（pH 9.6）中，將B液逐滴緩慢加入蛋白溶液中，并于室溫條件下攪拌反應(yīng)24 h；將終反應(yīng)液在4℃0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.4）中透析72 h，每隔8 h換液1次。最后將無色溶液封裝后于-20℃冰箱保存。

1.3.3 酶標(biāo)抗體的制備

使用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，制備方法參考張世偉等[13]的研究。將0.3 mg純化的抗體溶解于0.1 mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中。加入0.1 mL 10 mg/mL的活化醛基的辣根過氧化物酶溶液后4℃反應(yīng)過夜。加入30 μL 0.2 mol/L的賴氨酸終止反應(yīng)，透析純化后備用。

1.3.4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

每孔加100 μL包被抗原，37℃溫育2 h；傾去包被液，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1次，每孔加入200 μL封閉液，37℃溫育2 h，倒掉封閉液；每孔加入50 μL系列濃度的賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣品溶液）和50 μL酶標(biāo)單克隆抗體，25℃避光反應(yīng)40 min；洗滌4～5次后加入底物液A液（過氧化脲）和B液（四甲基聯(lián)苯胺）各50 μL/孔，25℃顯色15 min，2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)后，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定每孔吸光度值（OD450nm值）。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度0、0.05 μg/L、0.15 μg/L、0.45 μg/L、1.35 μg/L、4.05 μg/L，以質(zhì)量濃度為0 μg/L時(shí)的OD值為B0值，相應(yīng)賽庚啶濃度的OD值為B值，以評(píng)定模型Logit（B/B0）為縱坐標(biāo)，以賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實(shí)際質(zhì)量濃度。

1.3.6 樣本前處理方法的建立

用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取（2.0±0.05）g均質(zhì)后的樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中；加入0.3 mL 2 mol/L硫酸溶液和3.7 mL乙腈，用振蕩器振蕩5 min混勻，室溫條件下4 000 r/min離心5 min；移取2 mL上層有機(jī)相至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，輕輕振蕩20 s，再加入2 mL三氯甲烷和4 mL正己烷，用振蕩器振蕩5 min混勻，室溫條件下4 000 r/min離心5 min；移取2 mL上層有機(jī)相至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加? mL復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng)30 s，待檢。

1.3.7 ELISA方法的評(píng)價(jià)

敏感性：用半數(shù)抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）和檢測(cè)限來評(píng)價(jià)方法的靈敏度。測(cè)定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50，統(tǒng)計(jì)其平均值和浮動(dòng)范圍；測(cè)定20個(gè)空白樣本，求出其B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度的平均值（Xˉ）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），方法檢測(cè)限（method detection limit，MDL）=Xˉ+3S。

準(zhǔn)確性和重復(fù)性：用回收率和變異系數(shù)分別來評(píng)價(jià)ELISA方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。以三個(gè)不同質(zhì)量濃度的賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品分別對(duì)空白豬肉、牛肉、豬肝樣本進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

式中：Cx為添加了一定賽庚啶濃度的樣本經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際質(zhì)量濃度，μg/kg；C0為空白樣本經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際質(zhì)量濃度，μg/kg；C為實(shí)際添加的賽庚啶質(zhì)量濃度，μg/kg。

穩(wěn)定性：將ELISA方法涉及到的各種試劑制備足量保存于37℃環(huán)境中，每隔1 d取出適量，分別測(cè)定0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值、IC50及按上述方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)所得的回收率，直到方法的靈敏度和回收率開始下降為止，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷相關(guān)試劑的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

圖1 賽庚啶的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for cyproheptadine detection

在0.05～4.05 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Logit（B/B0）與賽庚啶質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見圖1），建立擬合回歸直線方程為Y=-2.051 8X-1.353 4，相關(guān)系數(shù)r為0.995 7，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.23 μg/L。

2.2 敏感性測(cè)定

統(tǒng)計(jì)20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50平均值為0.22 μg/kg，浮動(dòng)范圍為0.20～0.25 μg/kg；20個(gè)空白樣本的B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）見表1，綜合考慮幾種樣本的檢測(cè)限數(shù)據(jù)，本方法對(duì)動(dòng)物組織樣本的檢測(cè)限確定為0.3 μg/kg。

表1 方法對(duì)動(dòng)物組織的檢測(cè)限Table 1 Limit of detection for animal tissue

2.3 準(zhǔn)確性和重復(fù)性測(cè)定

取空白豬肉、牛肉、豬肝樣本，按表2所述的賽庚啶質(zhì)量濃度添加對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性測(cè)定Table 2 Accuracy and repeatability of ELISA method

由表2可知，以三個(gè)不同質(zhì)量濃度的賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)空白豬肉、牛肉、豬肝樣本進(jìn)行添加，其加標(biāo)回收率為85.1%～114.5%，樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)為5.2%～9.6%，＜10%，說明該ELISA方法測(cè)定動(dòng)物組織中賽庚啶殘留具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于動(dòng)物組織中賽庚啶殘留測(cè)定。

2.4 穩(wěn)定性測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，涉及到的各種試劑能在37℃條件下穩(wěn)定保存9 d，第10天開始各項(xiàng)參數(shù)出現(xiàn)下降。根據(jù)生化試劑在37℃每穩(wěn)定1 d，可相當(dāng)于4～10℃保存一個(gè)半月[14]，可知，若將這些試劑組裝成商品化試劑盒，可在4℃條件下至少穩(wěn)定保存12個(gè)月。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的單克隆抗體為基礎(chǔ)，初步建立了動(dòng)物組織中賽庚啶殘留檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法。該方法的IC50浮動(dòng)范圍為0.20～0.25 μg/L，對(duì)組織樣本的檢測(cè)限為0.3 μg/kg；賽庚啶陽性樣本加標(biāo)回收率為85.1%～114.5%，樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)為5.2%～9.6%，具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于動(dòng)物組織中賽庚啶殘留測(cè)定。賽庚啶競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法的建立，為進(jìn)一步開發(fā)免疫檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)[15]，并為食品和飼料中賽庚啶殘留的監(jiān)控提供了便捷、靈敏的檢測(cè)方法。

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Establishment of competitive enzyme linked immunosorbent assay for determination of cyproheptadine in animal tissue

WAN Yuping1,LUO Xiaoqin1,HAO Xiaomei1,CUI Tingting1,HUANG Baobing2,ZHU Liangliang1
(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 102206,China; 2.Datong Examine and Inspection Centre for Agriculture Products Safety and Quality,Datong 037004,China)

A competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)for fast detection of cyproheptadine residues in animal tissue was developed. The one step competitive ELISA method was established using cyproheptadine complete antigen as coating antigen and radish peroxidase labeled monoclonal antibody for reaction antibody.Results showed that the Logit/Log calibration curve was Y=-2.051 8X-1.353 4(correlation coefficient R= 0.995 7),the half inhibitory concentration(IC50)was 0.23 μg/L,and the limitation of detection for animal tissue was 0.3 μg/kg.The added standard recovery for cyporheptadine residues in animal tissue was in the range of 85.1%-114.5%,and the coefficient of variation was from 5.2%to 9.6%.The developed ELISA method could be applied to quantitative detection for cyproheptadine residues in animal tissue.

animal tissue;cyproheptadine;ELISA

R392-33

A

0254-5071（2014）10-0130-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.031

2014-07-16

快速檢測(cè)技術(shù)及電動(dòng)汽車相關(guān)產(chǎn)品和材料檢測(cè)驗(yàn)證技術(shù)研究與示范（2012BAK26B04）

萬宇平（1982-），男，獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)技術(shù)。