梁寶東，魏海香，王田田，張曉晶

（濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜273155）

響應面法優(yōu)化魚骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝

梁寶東，魏海香，王田田，張曉晶

（濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜273155）

在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化魚骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝參數(shù)。以乙酸鈉質量濃度、pH值、乙醇體積分數(shù)為考察因素，硫酸軟骨素得率為響應值，進行3因素3水平中心組合設計(CCD)試驗，獲得多元二次回歸方程。結果表明，硫酸軟骨素的最佳醇沉工藝為乙酸鈉質量濃度4.0 g/100 mL、pH值為6.0、乙醇體積分數(shù)60%，硫酸軟骨素實際提取率為1.910%。

魚骨；硫酸軟骨素；響應面分析法；醇沉

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是從動物軟骨組織中提取純化出的一種酸性黏多糖，主要來源于豬、牛及鯊魚等生物體，但家畜的軟骨產(chǎn)量很低，提取成本高[1]。CS在魚類軟骨中含量很豐富，如鯊魚骨中含50%～60%，但鯊魚由于捕撈過度而產(chǎn)量銳減，致使硫酸軟骨素生產(chǎn)受到影響。目前全世界每年硫酸軟骨素的產(chǎn)量僅為180 t左右，供不應求，已給藥品和化妝品的生產(chǎn)帶來了影響[2-3]。

我國魚頭魚骨資源相當豐富，從中提取硫酸軟骨素，既能減輕廢棄魚頭魚骨對環(huán)境造成的可能污染，又能使硫酸軟骨素產(chǎn)量大幅增加；既可緩解市場緊缺問題，又可出口創(chuàng)匯[4]。李川等[5]采用稀堿-酶解工藝對羅非魚頭中的硫酸軟骨素進行了提取，純度達81.28%，證明了方法的可行性。李瑞國[6]對硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝進行了實驗比較和改進，發(fā)現(xiàn)應避免濃堿提取和高溫，浸提液中的離子強度較大時有利于提高產(chǎn)品質量。陳紅麗等[7]對硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)堿提取和酶提取是提高得率和純度的兩個關鍵步驟。目前從魚骨中提取硫酸軟骨素的研究更多地側重于提取方法方面的研究。本研究以微山湖區(qū)產(chǎn)四鼻鯉魚魚骨為原料，經(jīng)過堿法提取和酶解得到浸提液，主要對浸提液中硫酸軟骨素的醇沉純化工藝進行了優(yōu)化，旨在為魚骨硫酸軟骨素的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魚脊骨、魚頭骨：市售。

1.1.2 試劑

復合蛋白酶（3.8×105U/g）、咔唑（分析純）、四硼酸鈉（分析純）：上海士鋒生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；鹽酸（36%）、硫酸（分析純）：萊陽市經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠；氯化鈉（分析純）：上海廣諾化學科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：西隴化工股份有限公司；無水乙醇（分析純）、體積分數(shù)為95%乙醇（分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；粒狀活性炭：天津市福晨化學試劑廠；無水乙酸鈉（分析純）：天津市風船化學試劑有限公司；硫酸軟骨素標準品（≥98%）：上海明圻化學試劑有限公司。

硼砂-硫酸試劑配制：四硼酸鈉0.953 4 g用濃硫酸定容至100 mL。

咔唑試劑配制：咔唑0.125 0 g用乙醇定容至100 mL，4℃低溫保存。

1.2 儀器與設備

DHG-9059B智能型電熱恒溫鼓風干燥箱：上?，槴\實驗設備有限公司；723PC可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；XB120A型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；RJP-350A型快速開蓋萬能高速粉碎機：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、TD6離心機：常州市華普達教學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚骨浸提液的制備

將冷凍狀態(tài)的魚骨流水解凍，投入80℃恒溫蒸煮鍋煮1 h，撈起、洗凈，去除含蛋白質、脂肪和其他不需要的部分，于電熱鼓風干燥箱中80℃烘干，粉碎，得魚骨骨粉。稱取200 g魚骨粉，與NaOH溶液（1 mol/L）按料液比1∶6（g∶mL）于50℃水浴中恒溫浸提6 h，提取過程中間歇攪拌，單層紗布過濾后收集濾液，把濾渣用同樣的方法再處理一次，雙層紗布過濾，然后把兩次的濾液合并，待處理。調整濾液pH值至7.0，加入1%的復合蛋白酶，50℃恒溫水解，酶解時不斷攪拌，2 h后將酶解液置于90℃水浴鍋中滅酶10 min，水冷迅速降至室溫。把滅活的酶解液pH值調至6.5，加入活性炭攪拌吸附1 h，靜置片刻后過濾。將三氯乙酸直接加入到上述濾液中，三氯乙酸的添加量達10%，邊加邊攪拌即產(chǎn)生沉淀，3 500 r/min離心10 min得上清液，棄沉淀，得魚骨浸提液[8-10]。

1.3.2 浸提液醇沉工藝流程[11-13]

1.3.3 魚骨中硫酸軟骨素含量的測定

（1）硫酸-咔唑法[14-15]

魚骨中硫酸軟骨素的含量采用硫酸-咔唑法進行測定。

（2）標準曲線的繪制

精確稱量硫酸軟骨素（CS）標準品2 mg，加水溶解并定容至50 mL，配制40 μg/mL的CS標準溶液。準確吸取CS標準溶液0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，分別置于25 mL具塞試管，用蒸餾水定至1 mL混勻，得一系列硫酸軟骨素標準溶液，在冰水浴條件下緩緩加入5 mL硼砂-硫酸試劑，注意避免出現(xiàn)沸騰。90℃水浴加熱20 min，振蕩混勻，冷水浴中迅速冷卻后，分別加咔唑試劑0.2 mL搖勻，置于90℃水浴加熱20 min，中間振蕩混勻，冷卻至室溫后于波長530 nm處測定其吸光度值。

（3）樣品中硫酸軟骨素含量測定

準確稱取樣品3 mg，加15 mL超純水溶解并稀釋，做3個重復，以超純水作為參比，按上述標準曲線的測定方法分別測定其吸光度值，樣品中硫酸軟骨素提取率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 硫酸軟骨素標準曲線制作

以硫酸軟骨素（CS）質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得到標準曲線見圖1。標準曲線線性回歸方程為y=0.009 0x+0.005 7，相關系數(shù)R2為0.999 1，表明二者線性關系良好。

圖1 硫酸軟骨素標準曲線Fig.1 Standard curve of chondroitin sulfate

2.2 乙酸鈉質量濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，分別加入乙酸鈉質量濃度為3.5 g/100 mL、4.0 g/100 mL、4.5 g/100 mL、5.0 g/100 mL、5.5 g/100 mL，攪拌溶解后調節(jié)溶液pH值為6.0，冷卻后加入一定無水乙醇使體系中乙醇體積分數(shù)為65%，4℃下靜置12 h后于5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察乙酸鈉質量濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結果如圖2所示。

圖2 乙酸鈉質量濃度對硫酸軟骨素提取率的影響Fig.2 Effect of sodium acetate concentration on extraction yield of chondroitin sulfate

由圖2可以看出，隨著乙酸鈉質量濃度的增大，硫酸軟骨素提取率逐漸提高，在乙酸鈉質量濃度為4.5 g/100 mL時達到最大值。當乙酸鈉質量濃度＞4.5 g/100 mL時，硫酸軟骨素的提取率出現(xiàn)下降趨勢，硫酸軟骨素提取率由2.03%下降到1.23%。這是因為當鹽離子濃度過大時導致一些雜質（某些蛋白質和有機鹽）溶出率增大繼而降低就了硫酸軟骨素的析出，使硫酸軟骨素的提取率降低。因此，乙酸鈉最佳質量濃度為4.5 g/100 mL。

2.3 pH對硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，在提取液中加入無水乙酸鈉，攪拌溶解使體系的乙酸鈉質量濃度為4.5 g/100 mL，分別調節(jié)提取液pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，冷卻后加入無水乙醇使體系中乙醇體積分數(shù)為65%，4℃下靜置12 h，5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察pH值對硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH對硫酸軟骨素提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of chondroitin sulfate

由圖3可以看出，隨著pH的增大，硫酸軟骨素提取率逐漸提高。在pH約為6.0時達到最大值，當pH＞6.0時硫酸軟骨素的提取率開始降低，由1.87%降到1.49%。這是因為硫酸軟骨素屬于兩性化合物，pH的變化會影響其所帶電荷的性質和數(shù)量，進而影響其在純化過程中的溶解度，當靜電荷數(shù)減少時，分子間吸引力增加，相互凝聚產(chǎn)生沉淀，使硫酸軟骨素的提取率降低。因此，最佳pH值為6.0。

2.4 乙醇體積分數(shù)對硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，在提取液中加入無水乙酸鈉，攪拌溶解使體系的乙酸鈉質量濃度為4.5 g/100 mL，調節(jié)提取液pH值為6.0并冷卻后加入無水乙醇使體系中乙醇體積分數(shù)為55%、60%、65%、70%、75%，4℃靜置12 h，5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察乙醇體積分數(shù)對硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增大，硫酸軟骨素的提取率逐漸提高，在乙醇體積分數(shù)為65%時提取率達到最大值（1.98%），在55%～65%時變化較明顯，當乙醇體積分數(shù)＞65%時，提取率開始降低，乙醇體積分數(shù)為75%時，提取率為1.3%。這是由于乙醇體積分數(shù)的升高，提高了某些蛋白質的溶解度，使硫酸軟骨素也隨之溶于乙醇溶液而沒有沉降下來。因此，最佳乙醇體積分數(shù)為65%。

圖4 乙醇體積分數(shù)對硫酸軟骨素提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on extraction yield of chondroitin sulfate

2.5 魚骨中硫酸軟骨素醇沉條件的響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken中心設計原理，結合單因素試驗結果，以無水乙酸鈉質量濃度（A）、pH值（B）、和乙醇體積分數(shù)（C）三因素為自變量，以硫酸軟骨素提取率（Y）為響應值，設計3因素3水平試驗，因素和水平見表1，結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.6 響應面方差分析

用Design-Expert程序對表2試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表3，并得出回歸方程如下：

模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.929 0，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為5.08%，說明該模型只有7.10%的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性較好。模型的F值為13.39，P＜0.000 1，表明該模型受外界干擾的幾率只有0.01%，是極其顯著的，模型擬合程度較好，自變量與響應值之間的線性關系顯著，可用于硫酸軟骨素純化工藝的預測和分析。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3得出，C、交互項BC、B2和C2對硫酸軟骨素提取率有顯著影響；A2對硫酸軟骨素得率影響高度顯著，而A、B、AB和AC對硫酸軟骨素得率的影響都不顯著。在所選的各因素范圍內，對硫酸軟骨素純化的影響排序為pH值（C）＞乙醇體積分數(shù)（B）＞乙酸鈉質量濃度（A）。

2.7 響應面交互作用分析與優(yōu)化

通過Design-Expert軟件繪制響應面曲線圖與等高線圖進行分析可進一步研究相關變量之間的交互作用以及最優(yōu)點，結果見圖5。

由圖5A可以看出，pH值為6.0時乙醇體積分數(shù)對硫酸軟骨素的純化影響較為顯著，硫酸軟骨素的提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高先升高再降低，這可能是由于乙醇體積分數(shù)的升高，提高了某些蛋白質的溶解度，使硫酸軟骨素也隨之溶于乙醇溶液而又沉降下來[8]。在試驗水平范圍內，乙酸鈉質量濃度和乙醇體積分數(shù)分別在4.0～5.0 g/100 mL和60%～70%范圍內時，硫酸軟骨素提取率可以達到最大值。

由圖5B可以看出，乙醇體積分數(shù)為60%時，pH值對硫酸軟骨素的純化影響較為顯著，硫酸軟骨素的提取率隨pH的升高先升高再降低。在試驗水平范圍內，乙酸鈉質量濃度和pH分別在4.0～5.0 g/100 mL和6.0～7.0范圍內時，硫酸軟骨素提取率可以達到最大值。

由圖5C可以看出，乙酸鈉質量濃度為4.5 g/100 mL時，硫酸軟骨素提取率隨乙醇體積分數(shù)和pH值的升高先升高再降低。在試驗水平范圍內，乙醇體積分數(shù)和pH分別在60%～70%和6.0～7.0范圍內時，硫酸軟骨素提取率可以達到最大值。

2.8 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert軟件分析得出3個影響因素的最佳組合為：乙酸鈉質量濃度4.5 g/100 mL，pH值為6.0，乙醇體積分數(shù)60%，該條件下硫酸軟骨素純化的提取率預測值為1.925%。為檢驗其可靠性，在該條件下重復試驗3次，硫酸軟骨素純化的提取率為1.910%，實測值與理論值基本吻合，說明響應面分析法得到的硫酸軟骨素純化工藝條件真實可靠，具有一定實用價值。

3 結論

本研究采用了從魚骨中提取硫酸軟骨素的醇沉工藝，采用單因素和響應面分析相結合的方法，分別考察了乙酸鈉質量濃度、乙醇體積分數(shù)和pH等因素對硫酸軟骨素醇沉工藝的影響，得到硫酸軟骨素最佳醇沉工藝：乙酸鈉質量濃度4.5 g/100 mL，pH值為6.0，乙醇體積分數(shù)60%，各因素的主效應關系為：pH（C）＞乙醇體積分數(shù)（B）＞乙酸鈉質量濃度（A）。此條件下硫酸軟骨素的提取率為1.910%。

[1]張雯.硫酸軟骨素的提取和純化[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學碩士論文，2009.

[2]方旭波，陳小娥.魷魚硫酸軟骨素糖蛋白的分離純化和鑒定[J].中國食品學報，2009，9（4）：103-108.

[3]陳丹青，李燕.黃鱔骨硫酸軟骨素提取純化的初步研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（6）：1075-1079.

[4]成長玉，段振華.響應面法優(yōu)化羅非魚下腳料硫酸軟骨素提取工藝的研究[J].食品科技，2011，36（3）：213-217.

[5]李川，陸振華，龍映均，等.羅非魚頭中硫酸軟骨素提取的工藝優(yōu)化[J].食品科學，2009，30（20）：234-237.

[6]李瑞國.硫酸軟骨素不同生產(chǎn)工藝的考察[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34（5）：221-222.

[7]陳紅麗，李玉，唐亮.硫酸軟骨素生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[J].河南化工，2006，23（3）：15-17.

[8]陳召國，楊文革.響應面法優(yōu)化豬硫酸軟骨素的提取工藝[J].食品科技，2011，36（7）：187-196.

[9]鄭江.鱘魚硫酸軟骨素的純化及其特征[J].水產(chǎn)學報，2008，32（3）：478-483.

[10]KUBO M,ANDO K,MIMURA T,et al.Chondroitin sulfate for the treatment of hip and knee osteoarthritis:current status and future trends [J].Life Sci,2009,10(9):433-438.

[11]SCHIRALDI C I,CARCARINO I L.Purification of chondroitin precursor from Escherichia coli K4 fermentation broth using membrane processing[J].Biotechnol J,2011,6(4):410-419.

[12]李利曉，夏延斌.正交實驗法優(yōu)化牛鼻軟骨中硫酸軟骨素的純沉工藝[J].食品工業(yè)科技，2012，33（16）：261-264.

[13]王亞兒.烏賊硫酸軟骨素的純化及其鑒別[J].中國食品學報，2013，13（12）：197-201.

[14]張莉.硫酸軟骨素含量測定方法的研究進展[J].天津藥學，2013，25（2）：44-46.

[15]傅應華.咔唑法測定鯊魚硫酸軟骨素含量的方法學研究[J].中國生化藥物雜志，2007，28（1）：54-56.

Optimization of alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone by response surface methodology

LIANG Baodong,WEI Haixiang,WANG Tiantian,ZHANG Xiaojing
(Department of Life Science and Engineering,Jining University,Qufu 273155,China)

On the basis of single factor experiment,response surface methodology was used to optimize alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone.Using sodium acetate concentration,pH value and ethanol concentration as investigation factors and chondroitin sulfate extraction ratio as response value,the optimal purification conditions were explored through a three-factor,three-level central composite experimental design and the multiple quadratic regression equation was acquired.Results showed that the optimum alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone was as follows:sodium acetate concentration 4.0 g/100 ml,pH 6.0,ethanol concentration 60%.The chondroitin sulfate extraction ratio was 1.910%.

fishbone;chondroitin sulfate;response surface methodology;alcohol precipitation

TS254.9

A

0254-5071（2014）10-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.025

2014-08-27

濟寧學院大學生研究性學習與創(chuàng)新性實驗計劃項目（CXL305）

梁寶東（1979-），男，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵及生物活性物質。