李燦美，楊 凌，劉 琳，李一輝，楊善蘭，金美四，賀振新

（1．大理州人民醫(yī)院 血液腫瘤科，云南 大理 671000；2．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液科，云南 昆明 650032；3．昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 血液科，云南 昆明 650101）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是起源于B淋巴細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明，常規(guī)化療效果差，迫切需要探索其發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療途徑。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的大量研究均已證實(shí)DNA甲基化是血液腫瘤抑癌基因失活的常見(jiàn)機(jī)制。p15基因都是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKI）家族的重要成員，是目前研究較多的抑癌基因。近十年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道中，MM患者p15基因甲基化的陽(yáng)性率在1.8%～75%之間[1,2]。各家的結(jié)果很不一致。為了探討p15基因甲基化與MM發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，我們采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP） 研究MM中p15基因甲基化與其mRNA轉(zhuǎn)錄阻抑的關(guān)系，為該病的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、臨床資料 選取2009年1月～2011年6月確診的54例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)自昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科和第二附屬醫(yī)院血液科，其中男性35例，女性19例，年齡38～79歲，中位年齡64歲，平均年齡（63.44±8.94）歲，包括初診患者27例，復(fù)發(fā)患者27例。Druie-Salmon分期：I期A組2例，II期A組16例，II期B組16例，III期A組19例，III期B組13例。所有病例診斷均符合標(biāo)準(zhǔn)[3]。對(duì)照組為非血液腫瘤患者骨髓標(biāo)本（主要為營(yíng)養(yǎng)不良性性貧血和免疫性血小板減少癥患者），共40例。

二、試劑和儀器 DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒為杭州Axygen Bioscigens公司產(chǎn)品。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，Zymo Taq PreMix TM Kit為美國(guó)ZYMO Research公司產(chǎn)品。 TRIzol Reagent抽提液，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDGKit等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PCR擴(kuò)增儀，qPCR擴(kuò)增儀和全自動(dòng)凝膠圖像分析儀均為美國(guó)Bio-rad公司的產(chǎn)品。p15基因甲基化的引物序列（參照文獻(xiàn)[4）]由上海invitrigen公司合成。qPCR引物采用primer3.0軟件設(shè)計(jì)，產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在100-150bp，并用NCBI primer blast進(jìn)行引物檢測(cè)，確認(rèn)為單一性產(chǎn)物。所有引物具體序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度見(jiàn)附表。

三、DNA與RNA的提取 基因組DNA的提取、DNA亞硫酸氫鹽修飾、修飾后模板的純化按Herman[4]方法。RNA的提取采用杭州Axygen Bioscigens公司的RNA提取試劑盒，按試劑盒操作步驟提取，并用分光光度儀測(cè)定RAN濃度。

四、MSP法檢測(cè)p15基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài) 1．已修飾并純化的DNA2μl，加入上下游引物各1μl，熱啟動(dòng)酶Zymo Taq Pre Mix25μl，加入RNase-Free＆DNase-Free ddH2O21μl，構(gòu)成總體積50μl的反應(yīng)體系。在反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性10min，95℃變 性30s，58℃退 火30s，72℃延 伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃鏈接7mim。最后進(jìn)行結(jié)果判定，取PCR產(chǎn)物5μl，2%瓊脂糖凝膠TBE電泳。電泳完畢后，取下凝膠，紫外線燈下觀察結(jié)果。以DNA marker2000bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，泳動(dòng)位置與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符的特異性產(chǎn)物判斷為陽(yáng)性，拍片記錄。2．將MSP擴(kuò)增產(chǎn)物50μl冰盒保存，送上海Invitrogen公司行全自動(dòng)測(cè)序技術(shù)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行拼接，BiQAnalyzer軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

五、RT-qPCR檢測(cè)p15基因mRNA表達(dá)情況1．RT-qPCR反應(yīng)體系，將提取的RNA用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA保存。取cDNA4μl，加入上下游引物 各1μl，Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG 25μl，加 入RNase-Free＆DNase-Free ddH2O 19μl，構(gòu)成總體積50μl的反應(yīng)體系。在反應(yīng)條件是50℃、95℃預(yù)變性各2mim，95℃變性15s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)，65-95℃溶解曲線1min下進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中以GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因，以標(biāo)準(zhǔn)化各個(gè)標(biāo)本中p15基因相對(duì)表達(dá)量，以Hela及HEPG2為質(zhì)控，以P15基因作為目的基因。2．結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)的數(shù)據(jù)由Bio-Rad CFX軟件進(jìn)行收集及分析。通過(guò)目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)行樣本間相對(duì)定量的比較。所有數(shù)值以相對(duì)于GAPDH基因升高或減少的倍數(shù)(Fold)表示。所有標(biāo)本的基因復(fù)制的數(shù)值均以閾值循環(huán)(Cycle threshold Ct)表達(dá)[3]。具體如下：目的基因的表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因)對(duì)照組，表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可直接得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因組的定量[4]。

附表 引物序列及退火溫度

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 甲基化情況分析采用四格表χ2檢驗(yàn)，基因表達(dá)分析以中位數(shù)加減四分位數(shù)間距進(jìn)行描述，兩組間采用隨機(jī)樣本秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，均以P≤0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（統(tǒng)計(jì)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包）。

結(jié) 果

一、MM患者p15基因的甲基化狀態(tài) 54例MM患者的MSP檢測(cè)結(jié)果為：p15基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化陽(yáng)性者有15例，甲基化率是27.778%，其檢測(cè)結(jié)果通過(guò)電泳均可見(jiàn)到一條148bP的甲基化陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大多數(shù)同時(shí)伴有154bp的甲基化陰性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（如圖1所示）。其余的39例多發(fā)性骨髓瘤患者只檢測(cè)到一條154bP的甲基化陰性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。40例正常人及非累及骨髓的血液病患者僅檢測(cè)到154bp的甲基化陰性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，均無(wú)甲基化。MM患者p15基因的甲基化率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

二、p15基因CpG島甲基化與多發(fā)性骨髓瘤某些臨床特征之間的關(guān)系

1．根據(jù)病程階段將所收集的多發(fā)性骨髓瘤患者分為初發(fā)及復(fù)發(fā)兩組。結(jié)果為初發(fā)組27例中9例p15基因甲基化，陽(yáng)性率為33.333%；而復(fù)發(fā)組27例中9例發(fā)現(xiàn)甲基化，陽(yáng)性率22.22%。初發(fā)和復(fù)發(fā)兩組多發(fā)性骨髓瘤患者P15基因CpG島甲基化率呈逐漸降低趨勢(shì)，初發(fā)組＞復(fù)發(fā)組。但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示初發(fā)組患者的p15基因甲基化率雖然高于復(fù)發(fā)組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2．根據(jù)所收集資料將多發(fā)性骨髓瘤患者以65歲的年齡分為兩組。結(jié)果為年齡≥65的組p15基因甲基化率為26.923%，而年齡＜65的組p15基因甲基化率28.571%對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行年齡分組對(duì)p15基因CpG島甲基化率進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3．根據(jù)所收集資料我們將多發(fā)性骨髓瘤患者以性別分為兩組。結(jié)果為男性的組p15基因甲基化率為26.923%，而女性組p15基因甲基化率28.571%。對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行性別分組對(duì)p15基因CpG島甲基化率進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

4．不同臨床分期，分組間多發(fā)性骨髓瘤患者p15基因CpG島甲基化狀態(tài)。對(duì)I，Ⅱ及Ⅲ期多發(fā)性骨髓瘤患者p15基因CpG島甲基化率進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。對(duì)A組和B組多發(fā)性骨髓瘤患者p15基因CpG島甲基化率進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

5．甲基化與非甲基化標(biāo)本測(cè)序結(jié)果分析。將MSP擴(kuò)增陽(yáng)性及陰性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行拼接，測(cè)序結(jié)果用BIQanalyzer軟件進(jìn)行分析，比對(duì)分析分析具體甲基化位點(diǎn)。結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2）：在p15基因啟動(dòng)子區(qū)5’端產(chǎn)物檢測(cè)出19處堿基發(fā)生甲基化。

圖1 MSP檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤患者P15基因Cp G島甲基化狀態(tài)

圖2 p15啟動(dòng)子區(qū)5'端甲基化與非甲基化序列比較圖

6．p15基因甲基化與其mRNA表達(dá)結(jié)果分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，偏度（Skewness，Sk）、峰度（Kutosis，Ku） 均＞0，提示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布。隨后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組、甲基化組和非甲基化組進(jìn)行Wilcoxon兩樣本秩和檢驗(yàn)。P15基因在mRNA表達(dá)水平上，實(shí)驗(yàn)組：28.64±28.77Fold；對(duì)照組：25.79±78.16Fold，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。甲基化組：28.64±19.13Fold；非甲基化組：29.86±29.24Fold；甲基化組與非甲基化組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；初診組：23.92±26.46Fold；復(fù)發(fā)組：36.13±27.65 Fold；甲基化組與非甲基化組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

DNA甲基化是哺乳動(dòng)物遺傳外修飾的重要調(diào)控方式，在基因表達(dá)調(diào)控，基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等方面有重要作用。研究表明，DNA甲基化模式改變與腫瘤形成有密切關(guān)系[5]。p15基因（又名CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，inhibits CDK4） 是定位于人類(lèi)第9號(hào)染色體9p21上的抑癌基因，是細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑（CDKI） 家族的重要成員。p15基因抑制細(xì)胞周期素依賴激酶（CDK4/6） 的活性，阻止Rb（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白） 基因磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F解離，使細(xì)胞周期在G→S轉(zhuǎn)換中停滯，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤都存在p15基因的甲基化失活現(xiàn)象，在各種類(lèi)型的急性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、前髓性白血病、成人淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤中都有p15基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化[6-7]；Martin等[8]發(fā)現(xiàn)p15基因的異常與漿細(xì)胞疾病有關(guān)，在多發(fā)性骨髓瘤中p15基因高甲基化是重要的事件。但Galm[1]等人的結(jié)論與之相反，他們?cè)?3例患者中僅發(fā)現(xiàn)1例p15基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。

我們的研究顯示，p15基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化比例明顯高于對(duì)照組，表明p15基因異常甲基化可能在MM發(fā)生中為重要失活機(jī)制。電泳發(fā)現(xiàn)有甲基化等位基因(M)擴(kuò)增的腫瘤標(biāo)本中往往可見(jiàn)非甲基化等位基因(U)的同時(shí)擴(kuò)增，考慮原因可能為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中混有正常細(xì)胞，難以排除正常DNA的干擾，在行MSP時(shí)非甲基化DNA和甲基化DNA的p15基因同時(shí)被擴(kuò)增，或者腫瘤細(xì)胞中P15基因的兩個(gè)等位基因有一個(gè)未發(fā)生甲基化之故，這兩種原因在電泳中難以區(qū)分。所以，我們對(duì)MSP產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其結(jié)果顯示：在p15啟動(dòng)子區(qū)5’端產(chǎn)物檢測(cè)出19處堿基位點(diǎn)發(fā)生甲基化。這表明p15啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是存在的。

我們?cè)噲D尋找p15基因甲基化與MM臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。但研究表明，性別，年齡，I，Ⅱ及Ⅲ期和A，B組的多發(fā)性骨髓瘤患者的p15基因CpG島甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Esteban等的結(jié)論一致[9]。提示p15基因甲基化可能是多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的一個(gè)早期作用環(huán)節(jié)。我們的研究表明，初發(fā)及復(fù)發(fā)兩組多發(fā)性骨髓瘤患者p15基因CpG島甲基化率呈降低趨勢(shì)，尤其初發(fā)組甲基化率略高于和復(fù)發(fā)組，但統(tǒng)計(jì)上并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這種降低趨勢(shì)提示p15基因甲基化可能與多發(fā)性骨髓瘤患者的化療反應(yīng)有關(guān)，但這種推測(cè)有待于進(jìn)一步增加樣本量來(lái)證實(shí)，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的化療藥物很少具有逆轉(zhuǎn)甲基化的作用，因此該結(jié)論的可信性有待進(jìn)一步論證。

雖然甲基化直接與基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，但是遺傳物質(zhì)DNA到蛋白質(zhì)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯特別是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中所轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少直接影響著相關(guān)最終蛋白質(zhì)的多少。因此本研究采用RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)來(lái)了解MM的進(jìn)展程度，治療效果及預(yù)后的判斷。研究結(jié)果顯示多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓液中p15基因mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05） ,甲基化組與非甲基化組，初診與復(fù)發(fā)組亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示尚不能根據(jù)p15基因mRNA的表達(dá)水平判斷多發(fā)性骨髓瘤的病理分期、進(jìn)展情況等。此結(jié)果不排除標(biāo)本量不足產(chǎn)生的結(jié)果偏差，需加大標(biāo)本量進(jìn)一步研究。同時(shí)該研究結(jié)果與王明鳴等[10]報(bào)道的U266細(xì)胞株接近，提示甲基化并非唯一調(diào)控p15mRNA表達(dá)的因素，其翻譯為蛋白的過(guò)程中還受到其他機(jī)制的調(diào)控。

總之，p15基因作為與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的重要抑癌基因，其甲基化的異常在多發(fā)性骨髓瘤中確實(shí)存在，MSP方法靈敏性高，因此使用MSP方法檢測(cè)p15基因的甲基化狀態(tài)將有可能成為檢測(cè)MM微小殘留病的一個(gè)指標(biāo)[11]，去甲基化的藥物可能是一種有效的治療方法[12]。

［1］GALM O,WILOPS,REICHELT J,et al.DNA methylation changes in multiple myeloma[J]．Leukemia,2004,18:1687-1692.

［2］CHIM CS,KWONG YL,FUNG TK,et al.Methylation profilingin multiplemyeloma[J]．Leuk Res,2004,28:379-385.

［3］張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]．第3版.北京：科學(xué)出版社，2007:232-235.

［4］HERMANJG,GRAFFJR,MYOHANENS,et al.Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]．Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(18):9821-9826.

［5］BAYLINSB.DNA methylation and gene silencing in cancer[J]．Nat Clin Pract Oncol,2005,Suppl 1:s4-11.

［6］AMARA K,TRIMECHEM,ZIADIS,et al.Prognostic significance of aberrant promoter hypermethylation of CpG islands in patients with diffuse large B cell lymphomas[J]．Ann Oncol,2008,19(10):1774-1786.

［7］YANGY,TAKEUCHIS,HOFMANNWK,et al.Aberrant methylation in promoter associated CpG islands of multiple genes in acute lymphoblastic leukemia[J]．Leuk Res,2006,30(1):98-102.

［8］MARTINP,GARCIA CM,SANTONA,et al.Aberrant gene promoter methylation in plasmacell dyscrasias[J]．Exp Mol Pathol,2008,84(3):256-261.

［9］ESTEBANB,ANGELOM,MARIA E,et al.Methylation status of nine tumor suppressor genes in multiple myeloma[J]．Int JHematol,2010,91:87-96.

［10］王明鳴，朱琦，任志宏，等.砷劑誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞SOCS1基因去甲基化的研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008,16（5）：1064-1068.

［11］BRIANAW,GARETH JM.Could DNA methylation become a useful measure for multiple myeloma prognoses[J]．Expert Rev Hematol,2011,4(2):125-127.

［12］SHENKER N,FLANAGAN JM.Intragenic DNA methylation:implication of this epigenetic mechanism for cancer research[J]．Brit Jof Cancer,2012,106:248-253.