鄭榮華，張?zhí)K麗，劉慧榮

(1．臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西臨汾 041000;2首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

先兆子癇(Preeclampsia，PE)是妊娠期特有的嚴(yán)重病癥，因其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多年來一直是引發(fā)孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因［1］。先兆子癇的基本病變過程為全身小動脈痙攣，外周血管阻力增高。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一系列病變的始動因素是內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)，但如何引起子癇前期患者體內(nèi)內(nèi)皮損傷的病理因素尚無定論［2］。

血管緊張素Ⅱ1型受體(AngiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R)過度激活是先兆子癇的典型病理改變［3］。1999 年，Wallukat等［4］證實(shí)，子癇前期患者體內(nèi)存在一種針對AT1受體的自身抗體(Autoantibody against the AT1R，AT1－AA)，可能是AT1R 過度激活的主要原因。AT1－AA可以專一識別AT1R的細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(The second extracellular loop of AT1R，AT1R－ECⅡ)，表現(xiàn)出類受體激動劑樣效應(yīng)，并與子癇前期的多種病理改變有關(guān)，提示該抗體可能是抗體參與疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。已有的研究發(fā)現(xiàn)，AT1R被激活后，可引起內(nèi)皮通透性增加［5］。給大鼠體內(nèi)注入AT1－AA后，血清中內(nèi)皮素－1(Endothelin－1，ET－1)的含量顯著增高［6］。以上現(xiàn)象提示，AT1－AA與內(nèi)皮活動異常密切相關(guān)，但AT1－AA引起何種形式的血管內(nèi)皮損傷目前尚不清楚。

血管細(xì)胞黏附因子－1(VCAM－1)屬于免疫球蛋白超家族類的黏附分子，其水平升高被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞活化與損傷的重要標(biāo)志［7］。并有研究發(fā)現(xiàn) VCAM－1可通過影響血管內(nèi)皮而成為先兆子癇發(fā)生的重要原因之一［8］。AT1－AA 是否能夠引起 VCAM－1 的升高，從而引起血管內(nèi)皮炎性癥狀，這對AT1－AA在先兆子癇發(fā)病機(jī)制中的研究中具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 動物分組及主動免疫模型的建立

商業(yè)合成人 AT1R－ECⅡ肽段(165－191，純度為95%，上海吉爾生化)，選用健康Wistar雌性大鼠作為免疫對象，隨機(jī)分為兩組，免疫組(n=8)和溶劑對照組(n=4)。利用本實(shí)驗(yàn)室建立的主動免疫動物模型方法進(jìn)行主動免疫［9］。免疫前鼠尾采血觀察抗體產(chǎn)生情況。

1．2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測大鼠血清中AT1－AA的水平

大鼠血清中AT1－AA的含量采用本實(shí)驗(yàn)室改良的ELISA法［10］動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果以光密度(OD)值表示。

1．3 免疫組化法測定血管細(xì)胞黏附分子－1

石蠟包埋組織，常規(guī)切片脫蠟至洗滌后，3%過氧化氫液室溫下孵育20 min(消除內(nèi)源性過氧化物酶)。切片經(jīng)抗原微波修復(fù)15 min，滴加封閉血清，室溫孵育10 min后棄去，加入一抗，放入冰箱4℃過夜。滴加免疫組化試劑，室溫30 min后DAB顯色液顯色5～10 min后［11］，鏡下觀察。以上每步操作后切片用PBS洗滌液沖洗(5 min/次×3次)。蘇木素復(fù)染，脫水、透明后用中性樹膠封片。每張切片隨機(jī)攝取6個視野，以大鼠胸主動脈壁平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，分析圖像并計算平均光密度(MOD)。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析，計量資料以±s表示，兩組比較用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 主動免疫AT1－AA陽性大鼠模型建立成功

主動免疫的8只Wistar雌性大鼠，在免疫1個月后，血清中有AT1－AA出現(xiàn)。抗體滴度從免疫兩個月開始直到結(jié)束，維持在較高的恒定水平(免疫9個月時OD 值 vs．同期溶劑對照組為1．79± 0．26 vs．0．43 ±0．15，P ＜0．05，見圖1)，表明主動免疫成功。

圖1 AT1R－ECⅡ主動免疫大鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的AT1－AAFig．1 The High Degrees of AT1-AA in the Wistar Rats Immunized with the AT1R-ECⅡ

2．2 免疫組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM－1表達(dá)顯著增強(qiáng)

免疫組化結(jié)果顯示，免疫組Wistar大鼠胸主動脈細(xì)胞VCAM－1表達(dá)比同期對照組(MOD值，0．27±0．04 vs．0．17 ±0．04，P ＜0．05，見圖 2)顯著升高，說明在AT1－AA長期刺激下內(nèi)皮細(xì)胞VCAM－1增高。見圖2。

圖2 兩組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM－1的表達(dá)Fig．2 The Expression of VCAM-1 of Vascular Endothelial Cell(VEC)in Two Groups of Rats

3 討論

本研究利用主動免疫方法建立血清中AT1－AA高滴度的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)在AT1－AA長期作用下，大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM－1表達(dá)上調(diào)。

大量研究證明，內(nèi)皮損傷是子癇前期中血管病變的重要起始環(huán)節(jié)，內(nèi)皮損傷導(dǎo)致血管保護(hù)性屏障作用消失，會引起血管發(fā)生病變的一系列嚴(yán)重后果。并有研究發(fā)現(xiàn)血管細(xì)胞黏附因子－1可通過影響血管內(nèi)皮而成為先兆子癇發(fā)生的重要原因之一［12］。

在1999年，Wallukat等研究證明有一種抗體為AT1－AA，與先兆子癇患者有著密切關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)這種抗體可以特異性識別AT1R－ECⅡ，發(fā)揮類受體激動劑樣作用，隨后其與先兆子癇的關(guān)系備受關(guān)注。已有研究證實(shí)，AT1－AA可作用于血管平滑肌細(xì)胞，引起細(xì)胞組織因子表達(dá)增加，NADPH氧化酶活化等［13－15］本研究也發(fā)現(xiàn)，AT1－AA可收縮離體的大鼠容量血管及阻力血管，并損傷血管內(nèi)皮。但AT1－AA究竟通過何種途徑損傷血管內(nèi)皮尚不清楚，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。本研究利用傳統(tǒng)的主動免疫方法，建立起AT1－AA長期陽性的動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，在AT1－AA的長期刺激作用下，大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM－1表達(dá)明顯增高，相應(yīng)證實(shí)模型中血管內(nèi)皮存在炎性損傷。為進(jìn)一步闡明在子癇前期發(fā)病過程中，AT1－AA直接參與血管病變的可能性及可能途徑提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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