李曼　王憲青　梁英

摘 要：試驗采用了超聲波輔助KOH-堿溶液進(jìn)行皂化工藝研究，以皂化堿液濃度、堿液加入量、皂化時間、皂化溫度為自變量。通過響應(yīng)面分析法，研究了各因素及其交互作用對萬壽菊中葉黃素皂化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：葉黃素皂化的最佳工藝條件為：KOH-堿溶液濃度11.35%、堿液加入量172.37mL、皂化溫度51.55℃、皂化時間2.09h。葉黃素含量的預(yù)測值為15.53mg/g。當(dāng)選取KOH-堿溶液濃度11%、堿液加入量170mL、皂化溫度50℃、皂化時間2h的實際條件時，葉黃素的含量實際值達(dá)到15.64mg/g。

關(guān)鍵詞：葉黃素；超聲波皂化；響應(yīng)面

萬壽菊原產(chǎn)墨西哥[1]，是一種一年生草本植物，我國各地均有栽培，其花和葉可入藥，有平肝清熱、化痰、補(bǔ)血通經(jīng)、去瘀生新、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功效[2]。它含有豐富的葉黃素，是一類含氧類胡蘿卜素，分子式：C40H56O2，分子量為568.85[4]，在體內(nèi)不能轉(zhuǎn)換為VA，沒有VA活性[5]。分子結(jié)構(gòu)的碳骨架由中央多聚稀鏈和位于兩側(cè)的六元碳環(huán)組成，它主要有胡蘿卜素類和葉黃素類兩類，前者是不含氧的類胡蘿卜素的總稱，后者是含氧類胡蘿卜素的總稱，包括葉黃素、玉米黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、辣椒紅素等[6]。

早在20世紀(jì)80年代中期，西方醫(yī)學(xué)界研究人員就發(fā)現(xiàn)：葉黃素在抗氧化、預(yù)防視網(wǎng)膜黃復(fù)病和白內(nèi)障疾病、冠心病及人體衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有著廣泛的生物活性[7～9]。近年來，研究表明葉黃素還可預(yù)防和改善癌癥、糖尿病、心血管疾病等多種慢性疾病[10～12]。鑒于葉黃素?zé)o毒安全，具有較強(qiáng)抗氧化、改善視力等生理功能，已被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、食品添加劑、保健食品、化妝品、醫(yī)藥、工業(yè)染料、水產(chǎn)品等行業(yè)[13]。

本研究采用以KOH和甲醇、異丙醇的三元混合溶劑為皂化液，同時采用超聲波輔助的方法進(jìn)行皂化反應(yīng)得到葉黃素。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出超聲波皂化葉黃素反應(yīng)的最佳工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用這一天然色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

萬壽菊顆粒，由林甸縣齊鑫天然產(chǎn)物有限公司提供；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品購于Sigma公司。試劑：THF（四氫呋喃）、甲醇、KOH、無水乙醇、醋酸、正丁醇。

1.1.2 儀器

KQ5200DE超聲波反應(yīng)器（昆山市超聲儀器有限公司）、Ⅲ性循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠產(chǎn)品 ）、FA-1004電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）、U-2001紫外分光光度儀（德國耶拿分析儀器股份公司）、HWS24恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、FW-80萬能粉碎器（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（揚州鴻都電子有限公司）、Surveyor高效液相色譜分析儀（美國Finnigan公司）、TGL-16B高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

葉黃素酯→超聲波輔助皂化→抽濾→調(diào)PH值→提取液濃縮→離心除去上清液→真空干燥→葉黃素。

1.2.2 操作方法

精確稱取葉黃素浸膏5g，加入2倍體積的四氫呋喃溶解，待溶解后，加入一定量一定濃度的KOH-堿溶液進(jìn)行超聲波（功率100W）皂化，皂化結(jié)束后，抽濾，用20%醋酸水溶液調(diào)pH值至中性，將濾液真空濃縮至無餾出液，離心去除上清液，收集葉黃素，真空50℃干燥24小時，得到葉黃素晶體。注意盡量避光。

1.2.3 測定方法

提取率的測定：取0.1g葉黃素用正己烷定容到25mL，用1cm比色皿以正己烷作空白在波長450nm處測定的其吸光度值。

葉黃素含量的計算：

葉黃素含量（mg/g）=

式中：Y為樣品溶液的定容體積（mL）；A為樣品的吸光度值；

E■■為吸光系數(shù)，為在1cm光程長的比色杯中1%（w/v）濃度溶質(zhì)的理論吸收值，取值2500。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配比液對皂化反應(yīng)的影響

由于甲醇、乙醇對KOH的溶解性好[14]，但對萬壽菊浸提物的分散性差，且乙醇易揮發(fā)，使得皂化反應(yīng)不能在較高溫度下進(jìn)行；異丙醇、正丁醇對萬壽菊萃取物的分散性較好，但對KOH的溶解性較差。而甲醇與異丙醇的相容性好，所以選擇甲醇與異丙醇的混合體系為溶劑既對KOH有很好的溶解性，又對葉黃素酯有很好的分散性，從而很好滿足了皂化需要。

表1 不同配比液對皂化反應(yīng)的影響

由表1可知：當(dāng)甲醇和異丙醇的體積比為4：1時，葉黃素含量最多，此時異丙醇已能很好分散葉黃素酯，異丙醇用量繼續(xù)增大時，葉黃素含量沒有明顯提高，而且進(jìn)一步增大異丙醇的用量會甲醇濃度下降，不利于溶解葉黃素酯，使得皂化反應(yīng)不完全。故確定甲醇和異丙醇的最佳體積比為4：1。

2.2 超聲波皂化反應(yīng)單因素考察

2.2.1 堿溶液濃度對皂化反應(yīng)的影響

圖1 堿溶液濃度對皂化反應(yīng)的影響

由圖1可知：隨堿濃度的增加，葉黃素的含量先增大后減??；當(dāng)堿溶液濃度小于10%時，葉黃素酯分散性不好，影響皂化反應(yīng)進(jìn)行，使葉黃素含量低；當(dāng)堿溶液濃度為10%時，葉黃素的含量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加溶液的體積分?jǐn)?shù)，葉黃素含量略有下降。能是葉黃素在強(qiáng)堿環(huán)境易分解，不穩(wěn)定[15]，使得葉黃素含量下降，故確定最佳料液比為10%。

2.2.2 堿溶液加入量對皂化反應(yīng)的影響

圖2 堿溶液加入量對皂化反應(yīng)的影響

由圖2可知：隨著堿溶液加入量的增加，葉黃素含量先增大后減小；在堿加入量為150mL時，葉黃素的含量達(dá)到最大值。可能因為生成的游離葉黃素單體在強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定進(jìn)而影響含量[16]；加堿量過大不僅浪費試劑，而且在皂化反應(yīng)過程中需要耗費大量的酸中和、去離子水洗滌，造成葉黃素?fù)p失，故確定最佳堿溶液加入量為150mL。

2.2.3 皂化溫度對皂化反應(yīng)的影響

圖3 皂化溫度對皂化反應(yīng)的影響

由圖3可知：隨著皂化溫度的增加，葉黃素含量先增大后減小；當(dāng)皂化溫度為50℃時，葉黃素含量達(dá)到最大值。當(dāng)皂化溫度大于50℃時，葉黃素的含量呈下降趨勢。分析原因：其一，溫度升高有利于脂類的溶解和堿液的分散，從而促進(jìn)皂化反應(yīng)的進(jìn)行；其二，葉黃素的熱穩(wěn)定性較差，當(dāng)溫度過高時游離的葉黃素易被氧化，影響葉黃素的含量；故確定最佳皂化溫度為50℃。

2.2.4 皂化時間對皂化反應(yīng)的影響

由圖4可知：隨著皂化時間的增加，葉黃素的含量先增大后減小；當(dāng)皂化時間為2h時，葉黃素含量最高；當(dāng)皂化時間超過2h時，葉黃素含量又呈下降趨勢。因為隨著皂化時間的延長，葉黃素在堿性條件下易發(fā)生氧化降解和異構(gòu)化[17]導(dǎo)致含量降低，故確定最佳皂化時間為2h。

2.3 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化

2.3.1 葉黃素皂化反應(yīng)綜合試驗方案和因素水平

利用SAS 9.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計[18]，選取KOH-堿溶液濃度、KOH-堿溶液加入量、皂化溫度、皂化時間4個單因素進(jìn)行顯著性分析，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 因素水平編碼表

2.3.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

對葉黃素皂化工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗方案見表3。

表3 二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計及實驗結(jié)果

各因素的四元二次回歸方程：

Y1=-6.86344+92.425*X1+0.014267*X2+0.423792*X3+4.7775*X4-228.5*X1*X1+0.0425*X1*X2-0.47*X1*X3-11.3*X1*X4-0.000068*X2*X2+0.000057*X2*X3+0.000725*X2*X4-0.003075*X3*X3-0.03025*X3*X4-0.4925*X4*X4

回歸方程方差分析見表4可知：在一次項中，KOH-堿溶液濃度、KOH-堿溶液加入量、皂化溫度和皂化時間對葉黃素均有顯著性影響（P<0.05）。在交互項中，四個因素之間對葉黃素的含量也達(dá)到顯著影響。而二次回歸模型的F值為16.52，大于F（14，12）0.01=4.05，且P<0.0001，而失擬性的F值為24.94，小于F（10，2）0.01=99.40，決定系數(shù)R2=0.9507，表明該模型極顯著。一次項，二次項F值均大于0.01水平上的F值，所以此回歸方程是有效可用于設(shè)計范圍內(nèi)預(yù)測所用。

2.3.3因素間的交互影響結(jié)果

根據(jù)交互作用方程，用SAS9.1軟件可以繪出Y14 、Y34的交互作用響應(yīng)曲面和等高線方程。

（1）KOH濃度和皂化時間的交互響應(yīng)曲面和二維等高線如圖5所示：

圖5 KOH濃度和皂化時間的響應(yīng)面圖和等高線圖

如圖5可知：當(dāng)KOH-堿溶液加入量150ml，皂化溫度是45℃時，KOH-堿濃度從6%向10%增大，而皂化時間從1.2h到2.1h也同時增大時，葉黃素的含量也是隨著KOH-堿濃度和皂化時間的增加而增加的。當(dāng)KOH濃度在10%時，皂化時間是2.1h時，兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大，葉黃素的含量達(dá)到最大值。當(dāng)KOH濃度從10%到14%，提取時間從2.1h到3h時，萬壽菊中葉黃素的含量隨著KOH濃度和皂化時間的增加而減少，說明兩者交互作用顯著，得到較大的響應(yīng)值。

（2）KOH-堿加入量和皂化時間的交互響應(yīng)曲面和二維等高線如圖6所示

圖6 KOH-堿加入量和皂化時間的響應(yīng)面圖和等高線圖

如圖6可知：當(dāng)KOH-堿濃度是10%，KOH甲醇加入量為150ml時，皂化溫度從36℃向50℃增大，提取時間從1.2h到2.1h增大時，葉黃素的含量隨著皂化溫度和皂化時間的增加而增加。當(dāng)皂化溫度在50℃，皂化時間在2.1h時，兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大，葉黃素的含量達(dá)到最大值。當(dāng)皂化溫度在50℃到54℃時，皂化時間在從2.1h到3h時，萬壽菊中葉黃素的含量隨著皂化溫度和皂化時間的增加而減少，說明兩者交互作用顯著，得到較大的響應(yīng)值。

2.3.4 驗證性試驗結(jié)果

對回歸方程模擬尋找最優(yōu)值，結(jié)果如下表5所示：

表5響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的驗證實驗結(jié)果

由表5可知，在響應(yīng)面法所預(yù)測的理論最佳提取條件下做三次驗證實驗，得出提取的葉黃素得率平均值為15.53%。綜上所述，確定的達(dá)到葉黃素酯得率最大值的最優(yōu)組合為：KOH濃度11%，KOH甲醇加入量170ml，皂化溫度50℃，皂化時間2h。

3 結(jié)論

以葉黃素酯為原料，考察了KOH濃度、KOH甲醇加入量、皂化溫度和皂化時間對葉黃素得率的影響，確定了單因素試驗的最佳提取條件是：KOH-堿溶液濃度11%，KOH-堿溶液加入量170ml，皂化溫度50℃，皂化時間2h。在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計四因素三水平的二次旋轉(zhuǎn)組合試驗，并通過分析，優(yōu)化萬壽菊中葉黃素的超聲波皂化工藝。確定最佳皂化條件為：KOH-堿溶液濃度11%，KOH-堿溶液加入量170mL，皂化溫度50℃，皂化時間2h，此條件下葉黃素得率達(dá)到15.64 %。驗證實驗結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致，說明此模型可依靠，對高純度葉黃素的提取和工業(yè)化生產(chǎn)具有參考價值。

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02-252.

作者簡介：李曼（1987.5-），女，學(xué)生，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2011級在讀研究生，食品科學(xué)專業(yè)。

*為通訊作者：梁英，女，黑龍江省賓縣人，教授，博士，主要從事中草藥有效成分提取分離與應(yīng)用研究。