馬學(xué)斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡

乙型肝炎病毒表面抗原對實(shí)體腫瘤患者CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)及表型分析的影響

馬學(xué)斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡

目的探討乙型肝炎病毒表面抗原陽性患者與陰性患者細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）體外培養(yǎng)過程中個(gè)細(xì)胞增殖情況和淋巴細(xì)胞亞群的變化。方法選取海軍總醫(yī)院2012年10月－2013年6月住院的腫瘤患者，共50例，根據(jù)乙型肝炎病毒表面抗原表達(dá)情況分為陰性組和陽性組。分別抽取患者外周血進(jìn)行CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，在第1、5、7、9、11、13、15天進(jìn)行細(xì)胞活力檢測并計(jì)數(shù)，第5、7、10、13、15天進(jìn)行各細(xì)胞亞群的表達(dá)分析。結(jié)果兩組患者CIK增殖情況單個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較無顯著性差異，但是在第15天的增殖倍數(shù)陽性組顯著高于陰性組（280倍比180倍）；細(xì)胞亞群分析中CD3＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD56＋T細(xì)胞比例均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而升高，CD4＋T細(xì)胞、CD3＋CD4＋T細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長而降低，陽性組更顯著；其中CD8＋T細(xì)胞和CD3＋CD4＋T細(xì)胞在兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論乙型肝炎病毒表面抗原陽性患者CIK細(xì)胞較陰性患者擴(kuò)增能力更強(qiáng)，效應(yīng)細(xì)胞表型表達(dá)更有利于殺傷作用的發(fā)揮。

乙型肝炎病毒表面抗原；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；細(xì)胞亞群

我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的高流行區(qū)，15～59歲人群HBV表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）陽性率8.12%［1］，所有腫瘤患者血清HBsAg陽性率8.98%［2］。HBV感染是導(dǎo)致中國人群肝腫瘤發(fā)生的重要因素，同時(shí)也與其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有很密切的關(guān)系。目前在對腫瘤進(jìn)行的綜合治療中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一種新型的免疫效應(yīng)細(xì)胞，由于其在體外增殖速度快、殺瘤譜廣，對自體腫瘤細(xì)胞具有特異性識(shí)別能力，殺傷活性高不受主要組織相容性復(fù)合體限制，對正常骨髓前體細(xì)胞毒性很小，對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感，可以抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的Fas-FasL凋亡等特點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注。有報(bào)道CIK細(xì)胞能夠明顯抑制HBV復(fù)制，安全無副作用［3］。但是對于HBsAg表達(dá)陽性與否對腫瘤患者外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響等，尚未見報(bào)道。本研究對此進(jìn)行了初步分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取海軍總醫(yī)院2012年10月－2013年6月住院的中晚期惡性腫瘤患者50例，男性28例、女性22例，年齡（53.42±13.32）歲；其中，肺癌15例，肝癌10例，鼻咽癌7例，乳腺癌6例，胃癌3例，腎癌2例，宮頸癌2例，其他惡性腫瘤5例；所有患者均經(jīng)過HBsAg、丙型肝炎病毒抗體、艾滋抗體和梅毒抗體檢測，所有患者除HBsAg檢測結(jié)果外，其他三項(xiàng)結(jié)果均為陰性。根據(jù)HBsAg檢測結(jié)果將研究對象分為陽性組（14例）和陰性組（36例）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），4000型低速離心機(jī)（日本Kubota公司），BCM型生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），Epics XL MCL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），XE-2100全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（日本Sysmex公司），LX-20全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2.2 試劑 無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液（GT-T551，日本Taraka公司），人淋巴細(xì)胞分離液（天津美德太平洋科技有限公司），D-磷酸緩沖液（Dulbecco′sphosphate buffered saline，D-PBS，日本Taraka公司），重組人源化白細(xì)胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2，北京雙露藥業(yè)公司），干擾素γ（Interferonγ，IFN-γ，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司），CD3單克隆抗體（古巴分子免疫學(xué)中心），CD3、 CD4、CD8、CD56熒光標(biāo)記抗體（美國Beckman Coulter公司），全血細(xì)胞分析試劑（日本Sysmex公司），XL-2100全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀配套試劑，生化檢測試劑（北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治療前淋巴細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)生化指標(biāo)的比較 在患者抽血進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)，取患者外周乙二胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium，EDTA K2）抗凝靜脈血2 mL，使用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測患者治療前淋巴細(xì)胞數(shù)量；同時(shí)，采集患者非抗凝靜脈血5 mL，待血液凝固后，離心分離血清，進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)的檢測。

1.3.2 CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)流程 所有入組患者簽署知情同意書后，早晨空腹用真空采血管采集外周靜脈血54 mL，在GMP實(shí)驗(yàn)室分離單個(gè)核細(xì)胞，用GT-T551無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入IFN-γ800 U／mL，加入10%的自體血漿，轉(zhuǎn)入用5μg／mL CD3單抗預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天添加培養(yǎng)液并加入rhIL-2 1 000 U／mL，期間根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)充GT-T551培養(yǎng)液和相應(yīng)的rhIL-2和自體血漿；培養(yǎng)至第5天，根據(jù)細(xì)胞生長增殖情況調(diào)整細(xì)胞密度，并轉(zhuǎn)入GT-T610（A）透氣培養(yǎng)袋進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每2～3 d根據(jù)細(xì)胞的生長增殖情況，補(bǔ)充GT-T551淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液、相應(yīng)的rhIL-2和自體血漿。分別于培養(yǎng)后的第5、7、10、13、15天進(jìn)行細(xì)胞表型分析，用胎盤藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力并計(jì)數(shù)；在培養(yǎng)的第13～15天，分3 d連續(xù)收集所有細(xì)胞，經(jīng)洗滌后配成200mL的細(xì)胞懸液，加入適量的白蛋白和白介素-2（interleukin-2，IL-2），混勻后送病房給患者回輸。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CIK細(xì)胞的淋巴細(xì)胞亞群

于CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第5、7、10、13、15天分別采取培養(yǎng)的細(xì)胞，加入適量的異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、或藻紅蛋白-花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）標(biāo)記的混合抗體，包括CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、CD3-FITC／CD56-PE。輕輕震蕩混勻后，室溫避光孵育20 min，加入PBS，顛倒混勻后1 500 r／min離心8 min，棄上清液，沉淀中加入適量PBS混懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測，每份樣本分析細(xì)胞數(shù)≥5× 104個(gè)，采集的數(shù)據(jù)使用流式細(xì)胞儀配套軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，計(jì)量數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析和多元方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況 兩組比較淋巴細(xì)胞、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、直接膽紅素 F分別為4.415、6.378、9.300、6.623、5.502，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組一般情況

2.2 兩組患者CIK細(xì)胞增殖數(shù)量 在CIK細(xì)胞增殖培養(yǎng)的第1、5、7、9、11、13、15天分別混勻培養(yǎng)中的細(xì)胞，取樣檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞密度，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞活力均≥98%，細(xì)胞計(jì)數(shù)兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），細(xì)胞生長曲線見圖1。兩組患者CIK細(xì)胞的增殖，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組CIK細(xì)胞均在第7天左右開始進(jìn)入快速增長期；至培養(yǎng)檢測的第15天，兩組CIK細(xì)胞仍處于對數(shù)生長階段，但是陽性組細(xì)胞數(shù)約為初始的280倍，高于陰性組的180倍。

表2 兩組患者CIK細(xì)胞增殖數(shù)量（×107個(gè)）

圖1 兩組CIK細(xì)胞生長曲線

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中淋巴細(xì)胞亞群 在培養(yǎng)過程中，分別于第5、7、10、13、15天收取兩組患者的CIK細(xì)胞，檢測淋巴細(xì)胞表面表型的變化。結(jié)果顯示，兩組患者的CIK細(xì)胞中CD3＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD56＋T細(xì)胞比例均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而呈升高的趨勢，其中陽性組升高較陰性組；CD4＋T細(xì)胞、CD3＋CD4＋T細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長而呈逐漸降低的過程，陽性組降低較陰性組更多（表3，圖2、3）。經(jīng)多因素方差分析，結(jié)果顯示CD8＋T細(xì)胞比例的升高和CD3＋CD4＋T細(xì)胞比例的降低在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間兩組腫瘤患者CIK細(xì)胞的表型變化（%）

圖2 兩組單陽細(xì)胞比率隨時(shí)間延長的變化

圖3 兩組患者CIK細(xì)胞表型隨時(shí)間延長的變化

3 討論

免疫療法有助于獲得HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)陰，恢復(fù)或改善缺陷的T細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，CIK細(xì)胞治療對于HBV DNA復(fù)制具有抑制作用，CIK細(xì)胞回輸后可以使慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平明顯下降，CIK細(xì)胞治療后患者病毒載量明顯下降者其CIK效應(yīng)細(xì)胞CD3＋CD56＋T細(xì)胞比例明顯高于治療無應(yīng)答者，提示免疫細(xì)胞數(shù)量和功能恢復(fù)與機(jī)體抗病毒能力的密切相關(guān)［4］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，多種因素影響腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［5-6］。本研究在免疫細(xì)胞治療惡性腫瘤的臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽性表達(dá)者在細(xì)胞回輸治療中的效果似乎要優(yōu)于HBsAg陰性表達(dá)者，為了深入研究HBsAg血清學(xué)水平對CIK細(xì)胞增殖的影響，我們對在海軍總醫(yī)院進(jìn)行生物治療的50例腫瘤患者的CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的分析研究。

對于入組患者初始的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽性組的數(shù)量要顯著的低于陰性患者，且陽性組患者的白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和直接膽紅素水平都要顯著高于陰性組患者的平均水平，顯示了HBsAg陽性表達(dá)對于患者的一般狀況是一個(gè)負(fù)性的影響，這與HBV的存在會(huì)影響人體的健康狀況是一致的［7-8］。對于來自組兩組患者的CIK細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示不論是HBsAg陽性或者陰性，CIK細(xì)胞的增殖都是大約從第7天開始進(jìn)入快速增長期，在細(xì)胞數(shù)量的增殖上相同時(shí)間點(diǎn)兩組比較沒有顯著性差異，但是第15天陽性組細(xì)胞的增殖倍數(shù)較第1天要高于陰性組（280倍比180倍），對于這一原因的分析認(rèn)為陽性組患者的淋巴細(xì)胞除與腫瘤細(xì)胞接觸被活化和識(shí)別外，還與HBV有接觸，接受雙重的刺激和激活，從而推測其可能具有更強(qiáng)的識(shí)別能力和殺傷活性［9］，在體外受到進(jìn)一步的刺激和活化時(shí)，更容易生長和增殖，因此在第15天的增殖倍數(shù)陽性組要顯著高于陰性組。

對淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的研究結(jié)果，CD3＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD8＋T細(xì)胞、CD3＋CD56＋T細(xì)胞均隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而升高，升高程度陽性組優(yōu)于陰性組；CD4＋T細(xì)胞、CD3＋CD4＋T細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，降低程度陽性組優(yōu)于陰性組。經(jīng)過多元方差分析，其中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是CD8＋T細(xì)胞和CD3＋CD4＋T細(xì)胞（P＜0.05），其余差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于這一現(xiàn)象的分析，由于在CIK這個(gè)異質(zhì)性細(xì)胞群中，主要的效應(yīng)細(xì)胞是CD3＋CD8＋T細(xì)胞和CD3＋CD56＋T細(xì)胞，在陽性組中CD3＋CD8＋T細(xì)胞升高較陰性組更為顯著；而CD3＋CD4＋T細(xì)胞屬于抑制細(xì)胞，對于CIK細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用具有抑制作用［10］，因此在培養(yǎng)過程中，把CD3＋CD4＋降到最低是提高效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性的重要環(huán)節(jié)，通過我們的研究分析可以看出，在陽性患者組中，CD3＋CD4＋T細(xì)胞的比例降低較陰性組更為顯著，這為HBsAg陽性患者CIK細(xì)胞回輸后具有更好的治療效果提供了理論依據(jù)。關(guān)于CIK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，也有認(rèn)為白介素-6的加入可以降低其中抑制細(xì)胞的比例，增加效應(yīng)細(xì)胞的增值和毒性［11］，具有更好的效果。

免疫治療對于惡性腫瘤及HBV的治療都是一種很有前途的治療策略［12-15］，如何有效地提高治療效果，更好地發(fā)揮其抗腫瘤和抗病毒作用，將是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，我們的分析研究樣本有限，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入研究。

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Effects of hepatis B vines on the grow th and cell subsets analysis of cytokine-induced killer cells（CIK）in vitro incubation from tumor

MA Xuebin1，2，MA Cong1，2，QIUWei1，ZHAO Jianling1，YUAN Hongxia1，YANG Jun1
（1.Biology Treatment Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，Chin；2.Department of Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo explore the difference of the immune cell subsets during the process of cytokine-induced kill cells（CIK）incubation from tumor patients with and without hepatitis B virus.MethodsThe peripheral blood was extracted from 50 tumor patients from Oct 2012 to Jun 2013 who were divided into two groups by with or without hepatitis B virus.The proliferate velocity and activity of CIK cellswere detected by count on 1，5，7，9，11，13 and 15 days of the CIK culture.The expressions of CD3＋，CD4＋，CD8＋，CD3＋CD8＋，CD3＋CD4＋，CD3＋CD56＋T cells were analyzed by flow cytometry on 5，7，10，13 and 15 days of the culture.ResultsThe proliferative multiple at15 days in HBV positive group was higher than that of negative group（280 vs.180），although there was no significant difference between the two groups at the same culturing time points. The frequencies of CD3＋T cells，CD8＋T cells，CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD56＋T cells increased by the time，whilethe CD4＋T cells and CD3＋CD4＋T cells decreased by the time，the positive group was more than the negative.Among them，the difference of CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells in two groups was significant（P＜0.05）.ConclusionThe proliferate multiple capacity of CIK cells from patients with HBV positive group was better than that of negative group，and the immune cell subsets states of HBV positive group was better than that of negative group..

Hepatitis B virus surface antigen；Cytokine-induced killer cells；Immune cell subset

R392.11；R392.12

B

2095-3097（2014）01-0022-05

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.006

2013-06-30 本文編輯：馮 博）

100048北京，海軍總醫(yī)院生物治療中心（馬學(xué)斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡），檢驗(yàn)科（馬學(xué)斌，馬 聰）

馬 聰，E-mail：macong958166＠163.com