曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明

·心血管疾病與轉(zhuǎn)化醫(yī)學·

體外誘導人臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化過程中APJ表達變化

曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明

目的研究人臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord Wharton′s Jelly-mesenchymal stem cells，HUW-MSCs）體外誘導向內(nèi)皮細胞分化過程中表面APJ受體表達的變化，探討APJ是否可作為鑒定內(nèi)皮細胞的早期細胞表面標志物。方法剖宮產(chǎn)取臍帶后分別用酶消化和組織貼壁法培養(yǎng)獲得臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞，用酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。取2×107第2代HUW-MSCs用單克隆APJ-APC熒光抗體標志后行流式分選，測定HUW-MSCs實驗前細胞表面表達APJ的水平。實驗分3組：誘導組MSCs用含血管內(nèi)皮細胞生長因子5μg／L、堿性成纖維細胞生長因子10μg／L、表皮生長因子10μg／L和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）M199培養(yǎng)基培養(yǎng)；共同培養(yǎng)組MSCs先與HUVECs在Transwell 6孔培養(yǎng)板中，用含10%FBS的M199培養(yǎng)5～7 d后轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的M199和培養(yǎng)1 d內(nèi)皮細胞的M199（2∶1）混合培養(yǎng)基；單純培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)基為含10% FBS的M199。培養(yǎng)周期為14 d。分別于第7、10、14天流式檢測各組細胞APJ表達水平，同時檢測內(nèi)皮細胞表面APJ水平作為陽性對照。另外于第7、14天檢測3個實驗組、內(nèi)皮細胞組、HUW-MSCs組內(nèi)皮細胞早期標志物CD309表達變化情況，比較各實驗組之間APJ與CD309變化趨勢。結(jié)果HUW-MSCs流式分選出5× 103APJ＋-HUW-MSCs，表面表達APJ基本呈陰性。誘導組、共同培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細胞形態(tài)均較HUWMSCs有顯著改變，誘導組呈圓形、線性、網(wǎng)狀，共同培養(yǎng)、單純培養(yǎng)組細胞呈卵圓形、長梭形。另外，誘導組生長最快，增殖能力最強；單純培養(yǎng)組次之；共同培養(yǎng)組細胞生長緩慢，增殖能力最弱。第7、10、14天，3組細胞CD309表達分別為誘導組1.8%、2.6%和8.8%，共培養(yǎng)組0.5%、2.5%和4.7%，單純培養(yǎng)組0.3%、2.1%和2.7%。第7、10、14天各組APJ陽性表達率分別為誘導組0.5%、0.9%和5.2%，共培養(yǎng)組0.4%、0.8%和3.0%，單純培養(yǎng)組0.2%、0.6%和2.1%。結(jié)論HUW-MSCs表面APJ表達基本呈陰性，HUW-MSCs向內(nèi)皮細胞誘導分化過程中APJ表達逐漸上調(diào)，與內(nèi)皮細胞早期標志物CD309變化趨勢基本一致，可作為早期內(nèi)皮細胞鑒定的標志物。

臍帶華通膠；間充質(zhì)干細胞；血管內(nèi)皮細胞；APJ受體；細胞標志物

1993年O′Dowd發(fā)現(xiàn)了7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體APJ，由位于11號染色體q12基因編碼。APJ的內(nèi)源性配體是Apelin，Apelin／APJ系統(tǒng)與腎素-血管緊張素系統(tǒng)存在高度的交互作用，在心血管系統(tǒng)中主要起正性變力、血容量和血壓調(diào)節(jié)作用。1996年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和胚胎中的脈管系統(tǒng)前體細胞表達APJ。近期，Vodyanik等［1］研究人胚胎干細胞定向誘導分化為中胚層細胞時，發(fā)現(xiàn)中胚層中存在表達APJ陽性的細胞，他們稱為間質(zhì)成血管細胞（mesenchymoangioblast），是間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞共同的前體細胞。本文研究體外經(jīng)血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等細胞因子和內(nèi)皮細胞非接觸共同培養(yǎng)兩種方法，定向誘導HUW-MSCs向內(nèi)皮細胞分化，觀察誘導過程中細胞表面APJ受體表達的變化，探討APJ是否可作為內(nèi)皮細胞的早期鑒定的細胞表面標志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、M199培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）美國Gibco公司，VEGF、bFGF、EGF美國PeproTech公司，APJ-APC美國R＆D公司，CD309-澡紅蛋白（phycoerythrin，PE）美國BD公司，Dil標記乙酰化低密度脂蛋白（Dil-labeled acetylated low density lipoprotein，DIL-Ac-LDL）美國Invitrogen公司，血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）武漢博士德生物公司，Transwell美國Corning公司，CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司，倒置顯微鏡日本Olympus公司，流式細胞儀美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUW-MSCs的分離與培養(yǎng) 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及孕婦知情同意后，取無菌新鮮的足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶。用磷酸鹽緩沖液（phosphate saline buffer，PBS）洗凈血污后剪成數(shù)段，沿臍靜脈剪開后剔除臍靜脈和臍動脈，剝離華通膠，用組織剪將無菌培養(yǎng)皿中華通膠剪碎成1 mm×1 mm×1 mm及以下組織塊，分別轉(zhuǎn)入75 cm2的培養(yǎng)瓶和50 ml離心管中。培養(yǎng)瓶中加入10 mL含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及1%青、鏈霉素的DMEM后置37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。離心管中加入Ⅱ型膠原酶浸沒華通膠組織后，置于37℃水浴箱消化12 h，待華通膠消化完全后，向消化液加入含20%FBS的DMEM（體積比1∶4）后分裝于75 cm2的培養(yǎng)瓶中后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細胞生長情況，待貼壁法和消化法培養(yǎng)瓶中開始出現(xiàn)細胞后首次半量換液，以后每3～4 d換液處理，細胞融合至90%左右傳代。

1.2.2 HUVECs的分離、培養(yǎng)與鑒定 將剝離的臍靜脈放入15 mL離心管中，加入0.25%胰酶浸沒組織后置于37℃水浴箱中消化13min，加入1mL FBS終止消化，收集消化液1 500 r／min×10 min離心，棄上清，加入含有10 mL 10%FBS及1%青、鏈霉素的M199培養(yǎng)液混勻，移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d換液處理，細胞融合至90%左右傳代。取第2代細胞消化離心，用PBS重懸后，以每管體積100μL分裝于3個15 mL離心管中，其中1、2管分別加入10μL CD309-PE和APJAPC等熒光抗體后孵育30min，第3管為對照組，將各組細胞進行流式細胞儀檢測。同時，將細胞分別接種于24孔板和96孔板，待細胞貼壁24 h，向24孔板中加入10μg／mL DIL-ac-LDL培養(yǎng)24 h后倒置熒光下觀察細胞攝取DIL-ac-LDL情況。96孔板細胞按照免疫組化試劑盒步驟檢測vWF。

1.2.3 HUW-MSCs分選與分組培養(yǎng) 取2×107第2代HUW-MSCs與APJ-APC抗體用1.2.2同樣方法孵育后進行流式細胞分選APJ＋-HUW-MSCs。重新取第2代HUW-MSCs分為3組，誘導組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組。誘導組細胞用含有VEGF 5μg／L、β-FGF 10μg／L、EGF 10μg／L和10%FBS＋1%青、鏈霉素M199培養(yǎng)液培養(yǎng)，共培養(yǎng)組為HUW-MSCs與HUVEC于Transwell中非接觸共同培養(yǎng)5～7 d轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)以HUVECs培養(yǎng)基與10% FBS＋1%青、鏈霉素M199混合液（1∶2）培養(yǎng)。單純培養(yǎng)組細胞以10%FBS＋1%青、鏈霉素M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 流式細胞儀檢測各亞組細胞APJ表達 細胞培養(yǎng)至第7、10、14天消化誘導組、共培養(yǎng)組、單純培養(yǎng)組及HUW-MSCs組細胞后制成細胞懸液，分別加入10μL APJ-APC及CD309-PE抗體孵育，然后流式細胞儀檢測4組細胞APJ及CD309的表達情況。流式細胞儀檢測前的細胞處理同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 HUW-MSCs培養(yǎng)與觀察 采用貼壁法培養(yǎng)的HUW-MSCs細胞一般7～10 d在組織塊周圍可見有爬出；消化法培養(yǎng)的細胞出現(xiàn)略早，5 d左右可在培養(yǎng)瓶底觀察到細胞貼壁生長。顯微鏡觀察兩種方法培養(yǎng)的細胞形態(tài)一致，均為短梭形（圖1a），呈克隆樣生長，3～5 d后細胞迅速融合。原代細胞消化傳代后生長加快，每3 d左右可傳代。HUW-MSCs擴增到第2代時，細胞形態(tài)穩(wěn)定。

2.2 HUVECs鑒定 顯微鏡下觀察HUVECs細胞呈橢圓形或多角形，呈鋪路石樣排列（圖1b）。HUVECs攝取DIL-ac-LDL，顯微鏡下觀察到紅色熒光（圖1c），vWF免疫組化（圖1d）結(jié)果呈陽性。流式檢測CD309和CD31表達率分別為1.8%和1.0%（圖2）。

2.3 HUW-MSCs、HUVECs、誘導組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細胞流式檢測CD309 流式檢測HUWMSCs和HUVECs表面CD309表達率分別為0.2%和1.8%（圖3）。第7、10、14天3個實驗組CD309的表達率逐漸上調(diào)，誘導組分別為1.8%、2.6%和8.8%，共同培養(yǎng)組為0.5%、2.5%和4.7%，單純培養(yǎng)組分別為0.3%、2.1%和2.7%（圖4）。

2.4 HUW-MSCs、HUVECs、誘導組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細胞流式檢測APJ HUW-MSCs表面APJ表達極低，2×107第2代HUW-MSCs經(jīng)流式分選出5×103，表達基本呈陰性。APJ受體在HUVECs表達較HUW-MSCs高，表達率為0.7%（圖5）。誘導組、共培養(yǎng)和單純培養(yǎng)組細胞于第7、10、14天流式檢測APJ表達，結(jié)果顯示各組細胞APJ表達均呈上調(diào)趨勢；其中誘導組分別為0.5%、0.9%和5.2%，共培養(yǎng)組分別為0.4%、0.8%和3.0%，單純培養(yǎng)組分別為0.2%、0.6%和2.1%（圖6）。3組表達APJ及CD309變化趨勢見圖7。

圖1 HUW-MSCs細胞培養(yǎng)和HUVECs鑒定

圖2 HUVECs表面CD309和CD31表達率

圖3 HUW-MSCs和HUVECs表面CD309表達率

圖4 3組CD309的表達率

圖5 HUVECs和HUW-MSCs表面APJ表達率

圖6 3組細胞APJ表達率

圖7 3組細胞表面表達CD309和APJ的變化趨勢

3 討論

APJ是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，跨膜區(qū)氨基酸序列與血管緊張素Ⅰ受體有54%的同源性；但不結(jié)合血管緊張素Ⅱ，兩者在心血管系統(tǒng)解剖分布中存在重疊，因此又稱為Apelin受體。人和鼠的APJ氨基酸序列的同源性達74%。Apelin是APJ目前已發(fā)現(xiàn)的唯一天然配體，廣泛存在于乳腺、肺、腦、脂肪和心臟等多個組織中，有Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等亞型。APJ與Apelin的分布不完全一致，主要在血管內(nèi)皮、心肌、血管平滑肌及脂肪組織，目前尚未發(fā)現(xiàn)APJ有亞型。Apelin／APJ系統(tǒng)的生理功能尚不明確。在循環(huán)系統(tǒng)，Apelin／APJ系統(tǒng)主要通過血管內(nèi)皮和平滑肌細胞發(fā)揮血壓和血容量調(diào)節(jié)的作用，在血管發(fā)生、抑制內(nèi)皮凋亡和平滑肌細胞增殖過程中也起重要作用，并與動脈粥樣硬化過程有關(guān)［2-3］。Gao等［4］認為Apelin／APJ系統(tǒng)與骨髓間充質(zhì)干細胞移植后與心肌再生和功能修復過程有關(guān)。在機體內(nèi)，容量、壓力負荷和血管緊張素Ⅱ均可調(diào)節(jié)APJ的表達［5］。Sheikh等［6］研究顯示，心血管疾病患者心臟和血管組織中APJ表達水平顯著下調(diào)，而低氧刺激能夠誘導缺血性心力衰竭的小鼠心肌細胞APJ表達上調(diào)。

間充質(zhì)干細胞是中胚層來源的多能干細胞。本實驗中，發(fā)現(xiàn)HUW-MSCs表面APJ的表達接近于陰性，而既往文獻報道骨髓間充質(zhì)干細胞中APJ表達陽性［4，7］。我們推測造成這種結(jié)果的原因可能有：①臍帶華通膠間充質(zhì)中由中胚層中間質(zhì)成血管細胞分化而來的干細胞數(shù)量極其稀少；②既往研究細胞APJ表達主要采用免疫組化，而本實驗中采用的是APJ單克隆熒光抗體，兩種檢測方法的結(jié)果可能存在一定差異。臍靜脈內(nèi)皮是大血管內(nèi)皮細胞，是目前體外研究最常用的人內(nèi)皮細胞，在本實驗中發(fā)現(xiàn)臍靜脈內(nèi)皮細胞表達APJ，但陽性率不高。這與Kleinz等［8］研究顯示在HUVECs的整個細胞質(zhì)中APJ-LI表達水平很低，而在靠近細胞核膜的細胞器中的APJ-LI稍高結(jié)果一致。實驗還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅰ刺激HUVECs后其APJ表達上調(diào)［9］。既往文獻報道在成人的整個脈管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細胞始終表達與APJ受體一致，但在脈管系統(tǒng)發(fā)育的早期階段，內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮前體細胞的APJ表達非常受限，而在新生血管的內(nèi)皮細胞中表達較高。目前還發(fā)現(xiàn)在腫瘤血管的內(nèi)皮細胞中APJ表達明顯提高［10］。對鋸齒類和兩棲類動物的胚胎發(fā)育的研究顯示：在胚胎早期，APJ于發(fā)育來源為背主動脈（dorsal aorta）的新生血管的內(nèi)皮細胞上表達，而在已存在的背主動脈內(nèi)皮細胞中APJ不表達［9］；內(nèi)皮前體細胞和新生的血管結(jié)構(gòu)中APJ表達水平較高，但隨著機體的發(fā)育成熟，APJ逐漸消失［9］。CD309又稱Flk-1、KDR，是血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2。文獻報道在干細胞向內(nèi)皮細胞分化第7天表達CD309，可作為內(nèi)皮細胞分化的早期標志物［11］。本研究中，發(fā)現(xiàn)各個實驗組細胞表面APJ和CD309表達均上調(diào)。3組APJ表達于第10天左右APJ檢測與HUVECs陽性率相當，且3組CD309在第7～10天之間達到HUVECs表達水平。但受實驗經(jīng)費所限，未能進行大量重復實驗，比較各組間不同時期APJ陽性表達差異。因此，我們推測APJ和CD309一樣，可作為內(nèi)皮細胞早期的表面標志物。

另外，我們觀察到采用M199培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSCs，其形態(tài)和增殖能力較DMEM培養(yǎng)的細胞有顯著變化，流式細胞儀檢測結(jié)果也證實其APJ表達陽性率提高。這與Saleh等［12］報道的內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基顯著影響MSCs的生物學行為相符。有研究者用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CR2）和完全培養(yǎng)基（M199）分別培養(yǎng)生殖細胞，結(jié)果顯示兩者對細胞分裂影響的差異沒有統(tǒng)計學意義，因此認為不是所有完全培養(yǎng)基中的化學組分是細胞分裂所必需的［13］。同時，該研究顯示血清或血清衍生物比基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的化學組分對細胞的影響更大，而血清的影響主要是其包含的生長因子起作用［13］。Lutolf等［14］則認為外部因素包括細胞外基質(zhì)成分、機械刺激，氧濃度、營養(yǎng)擴散及臨近細胞分泌的可溶性的調(diào)節(jié)因子均對細胞的生物學行為有影響。

內(nèi)皮細胞可通過影響外周環(huán)境調(diào)節(jié)MSCs的行為和分化能力［15］。Lozito等［16］研究顯示大血管和微血管的內(nèi)皮細胞的基質(zhì)成分明顯不同，與MSCs共培養(yǎng)時對MSCs分化的影響作用機制也不同。HUVEs來源于胚胎組織與成體來源的內(nèi)皮細胞存在差異［17］。因此，本實驗中采用了MSCs和HUVECs共培養(yǎng)的方法。在MSCs和HUVECs共培養(yǎng)體系中，我們發(fā)現(xiàn)MSCs隨著培養(yǎng)時間增殖能力顯著下降，這與既往文獻報道結(jié)果一致［15］。Saleh等［15］研究還顯示在內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)干細胞的共同培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細胞能夠調(diào)控間充質(zhì)干細胞的生物學行為，例如顯著影響MSCs增殖和成骨、成脂分化過程并促進Wnt／BMP信號系統(tǒng)激活等。另外，Ronkainen等［18］發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的心肌細胞能表達Apelin。因此，我們推測共同培養(yǎng)組較單純培養(yǎng)組APJ陽性細胞百分率更高的原因可能與HUVECs分泌Apelin或VEGF等細胞因子有關(guān)。

間充質(zhì)干細胞具有誘導分化為內(nèi)皮細胞的特性，使用VEGF、β-FGF、IGF及EGF等細胞因子可將MSCs成功誘導分化為血管內(nèi)皮細胞。VEGF能激活酪氨酸激酶受體，特異性地促進細胞分裂；在許多病理生理狀態(tài)下，VEGF對血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞等過程中起主要作用［7］。β-FGF創(chuàng)造了促進MSCs向血管內(nèi)皮樣細胞分化的微環(huán)境；EGF可刺激內(nèi)皮細胞增殖。本實驗中采用VEGF、β-FGF及EGF 3種細胞因子聯(lián)合誘導MSCs后發(fā)現(xiàn)，誘導組細胞生長、分裂能力增強伴細胞形態(tài)學變化，同時APJ表達上調(diào)且幅度較共培養(yǎng)及單純培養(yǎng)組更加顯著。Kidoya等［9］研究也顯示VEGF、β-FGF在體外均能上調(diào)內(nèi)皮細胞APJ和Apelin的表達；同時，還發(fā)現(xiàn)在VEGF的作用下，Apelin具有促進內(nèi)皮細胞的增殖和細胞與細胞之間的聚集作用［9］，但Apelin促進內(nèi)皮細胞遷移和增殖的效應不是通過上調(diào)VEGF或FGF等生長因子表達而實現(xiàn)的［19］。

［1］Vodyanik MA，Yu J，Zhang X，et al.A mesoderm-derived precursor formesenchymal stem and endothelial cells［J］. Cell Stem Cell，2010，7（6）：718-729.

［2］Hashimoto T，Kihara M，Imai N，et al.Requirement of apelinapelin receptor system for oxidative stress-linked atherosclerosis［J］.Am JPathol，2007，171（5）：1705-1712.

［3］Chun HJ，Ali ZA，Kojima Y，et al.Apelin signaling antagonizes AngⅡ effects in mouse models of atherosclerosis［J］.JClin Invest，2008，118（10）：3343-3354.

［4］Gao LR，Zhang NK，Bai J，et al.The apelin-APJ pathway exists in cardiomyogenic cells derived from mesenchymal stem cells in vitro and in vivo［J］.Cell Transplant，2010，19（8）：949-958.

［5］Pitkin SL，Maguire JJ，Kuc RE，et al.Modulation of the apelin／APJ system in heart failure and atherosclerosis in man［J］.Br JPharmacol，2010，160（7）：1785-1795.

［6］Sheikh AY，Chun HJ，Glassford AJ，et al.In vivo genetic profiling and cellular localization of apelin reveals a hypoxia-sensitive，endothelial-centered pathway activated in ischemic heart failure［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2008，294（1）：H88-H98.

［7］Zeng X，Yu SP，Taylor T，etal.Protective effectofapelin on cultured rat bone marrow mesenchymal stem cells against apoptosis［J］.Stem Cell Research，2012，8（3）：357-367.

［8］Kleinz MJ，Skepper JN，Davenport AP.Immunocytochemical localisation of the apelin receptor，APJ，to human cardiomyocytes，vascular smoothmuscle and endothelial cells［J］.Regul Pept，2005，126（3）：233-240.

［9］Kidoya H，Ueno M，Yamada Y，et al.Spatial and temporal role of the apelin／APJsystem in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis［J］.EMBO J，2008，27（3）：522-534.

［10］Kidoya H，Kunii N，Naito H，et al.The apelin／APJ system induces maturation of the tumor vasculature and improves the efficiency of immune therapy［J］.Oncogene，2012，31（27）：3254-3264.

［11］Oswald J，Boxberger S，J?rgensen B，et al.Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro［J］.Stem Cells，2004，22（3）：377-384.

［12］Saleh FA，Whyte M，Ashton P，et al.Regulation of mesenchymal stem cell activity by endothelial cells［J］.Stem Cells Dev，2011，20（3）：391-403.

［13］Wang S，Liu Y，Holyoak GR，et al.The effects of bovine serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre-and postcleavage-stage bovine embryos cultured in modified CR2 and M199 media［J］.Anim Reprod Sci，1997，48（1）：37-45.

［14］Lutolf MP，Gilbert PM，Blau HM.Designingmaterials to direct stem-cell fate［J］.Nature，2009，462（7272）：433-441.

［15］Saleh FA，Whyte M，Genever PG.Effects of endothelial cells on humanmesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitromodel［J］.Eur CellMater，2011，22：242-257.

［16］Lozito TP，Kuo CK，Taboas JM，et al.Humanmesenchymal stem cells express vascular cell phenotypes upon interaction with endothelial cell matrix［J］.J Cell Biochem，2009，107（4）：714-722.

［17］Goldbrunner RH，Wagner S，Roosen K，et al.Models for assessment of angiogenesis in gliomas［J］.JNeurooncol，2000，50（1／2）：53-62.

［18］Ronkainen VP，Ronkainen JJ，H?nninen SL，et al.Hypoxia inducible factor regulates the cardiac expression and secretion of apelin［J］.FASEB J，2007，21（8）：1821-1830.

［19］Cox CM，D′Agostino SL，Miller MK，et al.Apelin，the ligand for the endothelial G-protein-coupled receptor，APJ，is a potent angiogenic factor required for normal vascular development of the frog embryo［J］.Dev Biol，2006，296（1）：177-189.

·資 訊·

每日服用阿司匹林可降低卵巢癌風險

美國國家癌癥研究所一項新研究顯示，每天服用阿司匹林女性罹患卵巢癌風險可以降低20%。卵巢癌是女性健康的一大威脅，每年僅美國就有逾2萬例確診患卵巢癌，1.4萬名女性死于這種疾病。早期卵巢癌可成功治療，但早期卵巢癌癥狀與消化系統(tǒng)疾病和膀胱疾病類似，因此卵巢癌常常到晚期才被發(fā)現(xiàn)。

阿司匹林具有抗炎癥的效果，之前研究顯示每日服用阿司匹林能夠降低罹患結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤等癌癥的風險，因而開展了迄今最大型的研究來評估阿司匹林與卵巢癌風險之間的關(guān)系。

研究人員分析了來自約8 000例卵巢癌患者和近1.2萬名未罹患卵巢癌女性的數(shù)據(jù)，這些人中有18%經(jīng)常服用阿司匹林。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與每周服用阿司匹林不到1次的女性相比，每天服用阿司匹林的女性患卵巢癌風險降低了20%。其機制可能通過誘導凋亡、抑制血管生成及增加細胞免疫發(fā)揮作用。相關(guān)論文發(fā)表在Journal of the National Cancer Institute雜志上。研究表明，阿司匹林也可以降低卵巢癌風險，但這一結(jié)果不應影響當前的臨床實踐，還需要更多的研究以探索這種潛在防癌藥物的風險與益處的平衡。

（摘自：Tsoref D，Panzarella T，Oza A.Aspirin in prevention of ovarian cancer：arewe at the tipping point？［J］.JNatl Cancer Inst，2014，106（2）：djt453. 編輯部）

Expression and variance of APJ in umbilical cord-derived hum an mesenchymal stem cells induced into endothelial cell in vitro

CAO Fangying1，2，ZHANG Ningkun2，GAO Lianru2，ZHU Zhiming2
（1.Department of Reseach，Southern Medical University，Guangzhou Guangdong 510515，China；2.Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo explone the expression and variation，induced by cytokines in vitro，of APJ inmesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton′s Jelly.To identify APJ is whether a surface mark of vascular endothelial cell or not in prophase of differentiation.MethodsThe umbilical cord was obtained from cesarean section.We isolated the Wharton′s Jelly and umbilical veins endothelial cells and cultured the adherent cells.Cells labeled with monoclonal fluorescent antibody reaching up to 2×107of P2 generation were undergone sorting through flow cytometer.Cells were divided into 3 subgroups，induction，coculture and haplo-cultivation.The concentration ofVEGF，β-FGF and EGF in culture media，M199，for induction subgroup was 5μg／L，10μg／L，10 μg／L respectively.MSCs were first cocultured with HUVEC in non-contact system by Trans well for 5－7 days，then we fed them withmixed M199making up with fresh media and suction from endotheliocyte in volume ratio of 1∶2 in common culture flask.All of the M199 contained 10%FBS and 1% mycillin.The whole cultivation cycle was fortnight，and we checked out the APJ in 3 subgroups in d7，d10 and d14 and CD309 in d7，d10 and d14 respectively.ResultsAbout five thousands of APJ＋-HUW-MSCswas obtained after sorting.Morphous of cells in 3 subgroups had changed dramatically compared to MSCs cultured by EMEM／F12，which presented shapes as follow round，filate and reticulum cells in induction group，oval and elongated fusiform cellswere coculture and haplo-cultivation.As for reproductive activity，the most was induction，the weakest was coculture.Expression of CD309 in d7，d10 and d14 of the induction，coculture and haplo-cultivation were（1.8%vs.2.6% vs.8.8%），（0.5%vs.2.5%vs.4.7%）and（0.3%vs.2.1%vs.2.7%）respectively.The percentage of APJpositive cells in induction were（0.5%vs.0.9%vs.5.2%）in d7，d10 and d14，（0.4%vs.0.8%vs.3.0%）respectively with coculture.In haplo-cultivation，they were（0.2%vs. 0.6%vs.2.1%）.ConclusionExpression of receptor APJ in the surface of MSCs is approaching to negative.In the induction of HUW-MSCs into vascular endothelial cells，APJexpression enhance gradually in accordance with CD309，a pristine mark of vascular endothelial cells，and APJmay be a new mark of identification of vascular endothelial cells in prophase of differentiation.

Wharton′s Jelly；Mesenchyma stem cells；Vascular endothelial cell；APJ receptor；Surface mark

R329.2＋4；Q254

A

2095-3097（2014）01-0031-06

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.008

2013-03-13 本文編輯：徐海琴）

海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金（CX201101）

510515廣東廣州，南方醫(yī)科大學研究生部（曹芳英）；100048北京，海軍總醫(yī)院心臟中心（曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明）

朱智明，E-mail：zhuzhiming6542＠sina.com