杜幸潔，張峰，張慧曉，文永佳，薩仁托雅

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一廣譜抗生素，對革蘭陽性、陰性細菌均有抑制作用，但對陰性細菌的作用較強。由于氯霉素價格低廉、抗菌效果佳、藥性穩(wěn)定，在生產(chǎn)實踐中常被作為飼料添加劑，用于預(yù)防、治療細菌性疾病。然而CAP 對人體具有嚴重的毒副作用，它能抑制人體骨髓造血機能，導(dǎo)致各類血細胞減少，尤其是白細胞，而且它還容易引起人體再生障礙性貧血等，因此，CAP的殘留限量標準在歐盟、美國等有關(guān)法規(guī)中規(guī)定為“零容許量”。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定CAP 及其鹽、脂等在食品動物的所有可食組織中不得檢出［1］。

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)，又稱為分子烙印技術(shù)，對其理論基礎(chǔ)的研究主要有Fischer［2］的酶與底物作用的“鎖與鑰匙模型”、Pauling［3］早期提出的抗體形成學說和Dickey［4］的“專一性吸附理論”。分子印跡技術(shù)是以待測物或其結(jié)構(gòu)類似物為模板分子，模擬自然界所存在的分子識別原理(如酶與底物、抗體與抗原等特異性識別)，合成具有專一識別功能的分子印跡聚合物(molecular imprinting polymers，MIP)的一種技術(shù)［5］。分子印跡聚合物因其制備簡單，能專一識別目標分子，而且具有穩(wěn)定性高、能重復(fù)使用、抗惡劣環(huán)境能力強(如抗酸、抗堿、抗高溫)等特點而被越來越廣泛地應(yīng)用于很多領(lǐng)域。目前，所報道的氯霉素分子印跡膜大多是以電極［6-7］、濾膜［8］為支撐體合成的，主要被用于生物傳感器［6-7］等，而以96 孔板為支撐體合成氯霉素分子印跡膜被用作人工抗體的研究尚未見報道。

本研究中采用本體聚合法，以氯霉素為模板分子，四氫呋喃為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用紫外燈引發(fā)聚合，在96 孔板上合成氯霉素分子印跡聚合膜，并且通過試驗優(yōu)化了該分子印跡膜的制備方法，為下一步用該膜代替氯霉素的生物抗體，采用直接競爭原理，合成酶標氯霉素，應(yīng)用化學發(fā)光免疫法［9-10］檢測氯霉素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑:氯霉素(CAP，98%)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEM，99%)、四氫呋喃(THF，99%)、偶氮二異丁腈(AIBN，99%)、甲砜霉素(TAP，99.5%)、氟甲砜霉素(FF，98%)、甲基丙烯酸(MAA，99%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，99%)均購自阿拉丁試劑公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%)購自Sigma公司;甲醇、乙酸均購自上海生工生物有限公司;甲醇、乙酸均為分析純。

儀器:Q3200B-型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)、ZW-A 微量振蕩器(常州澳華儀器有限公司)、HGC-12A 氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)、100 W紫外燈(λ=365 nm，飛利浦進口光源有限公司)、高效液相色譜儀(HPLC，大連依利特分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CAP 分子印跡聚合物的合成 稱取80 mg CAP 放入25 mL 圓底燒瓶中，并向瓶中加入5 mL THF，超聲處理5 min;待CAP 溶解后向其中加入200 μL DEAEM，超聲處理20 min;再加入50 μL EGDMA和0.02 g AIBN，超聲處理20 min;超聲處理結(jié)束后，以每孔25 μL 將混合液滴加到96 孔板上，將板放入密封袋中，充入氮氣15 min，密封;將袋置于100 W 紫外燈下照射6 h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，用100 mL 甲醇乙酸混合液(二者的體積比為3∶1)超聲洗脫模板分子，每4 h 更換一次洗脫液，用HPLC 檢測，直至洗脫液中檢測不到模板分子為止。

非印跡聚合物(NIP)的合成除不加入模板分子CAP 外，其余步驟同上。

1.2.2 聚合物吸附性能的測定 配制一系列CAP甲醇溶液(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L)，將其分別以每孔200 μL 滴加到MIP和NIP 中，再將MIP和NIP 置于振蕩器上振蕩80 min，結(jié)束后用HPLC 檢測各種溶液中CAP 的濃度。每孔吸附量的計算公式為

其中:CI、CF分別為吸附初始和吸附結(jié)束后CAP甲醇溶液的濃度;V 為加入溶液的體積。

1.2.3 聚合物的吸附動力學曲線及吸附特異性分別配制初始濃度為50 mg/L 的CAP 甲醇、TAP甲醇和FF 甲醇溶液，以每孔200 μL 分別滴加到MIP 96 孔板上，振蕩不同時間(5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)，用HPLC 檢測各種溶液中CAP、TAP和FF 的濃度，擬合得到3種物質(zhì)的動吸附力學曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 CAP 96 孔板分子印跡聚合膜制備條件的優(yōu)化

2.1.1 功能單體的選擇 試驗中模板分子CAP和交聯(lián)劑EGDMA 的用量固定不變，選擇MAA、4-VP和DEAEM 為功能單體，以合成聚合物的最終吸附性為指標，檢驗3種功能單體合成聚合物的優(yōu)劣。結(jié)果表明，以DEAEM 為功能單體，合成的CAP 分子印跡膜的吸附速率最快，能在50 min 內(nèi)達到吸附平衡，而以MAA和4-VP 為功能單體，合成的印跡膜則吸附慢且吸附量少(表1)。所以，本試驗中選用DEAEM 為功能單體。

表1 不同功能單體對分子印跡聚合膜吸附性的影響Tab.1 Influence of the functional monomers on the adsorption on imprinted film

2.1.2 功能單體用量的選擇 試驗中模板分子CAP和交聯(lián)劑EGDMA 的用量固定不變，按照CAP與功能單體DEAEM 的摩爾比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，選用不同用量的DEAEM，制備一系列聚合物，洗脫后測定其吸附量。從表2可見:當CAP 與DEAEM 的摩爾比不超過1∶4 時，隨著DEAEM 用量的增大，CAP 分子印跡聚合膜對CAP 的吸附量也隨之增加，可能是隨著功能單體用量的不斷增加，形成的CAP 分子空穴越來越多，因此聚合膜的吸附量也不斷增加;當DEAEM 的用量為1.00 mmol 時，聚合膜的吸附量達到最大(1.49 μg/孔);當CAP 與DEAEM 的摩爾比超過1∶4 時，聚合膜的吸附量反而減小，可能是因為功能單體過多時發(fā)生自體聚合，影響了CAP 分子空穴的形成，導(dǎo)致聚合膜的吸附量減少。所以，本試驗中選用模板分子CAP 與功能單體DEAEM 的摩爾比為1∶4。

2.1.3 溶劑的選擇 溶劑不僅給每個反應(yīng)物質(zhì)提供了一個良好的聚合反應(yīng)環(huán)境，而且在聚合物形成過程中還充當著致孔劑的作用。常用于聚合反應(yīng)的有機溶劑有THF、乙醇、乙腈等。本試驗結(jié)果表明，利用乙醇和乙腈作為溶劑在96 孔板上合成的聚合物均不規(guī)則，可能是由于乙醇和乙腈揮發(fā)性太強，導(dǎo)致孔壁上都粘有聚合物，有時甚至都揮發(fā)到密封袋上，給后續(xù)的吸附試驗和檢測帶來很多困難，而且交聯(lián)劑用量少時，用乙醇作溶劑合成的聚合膜不能牢固地粘到板上，易脫落，形成的聚合膜易碎，洗脫時聚合膜易融化在甲醇乙酸混合洗脫液中。而用THF 作為溶劑，制備的CAP 聚合膜能牢固地粘在板上，無論如何洗脫都不會脫落，孔壁上也未粘有聚合物，洗脫后板可重復(fù)使用。所以，本試驗中選用THF 作為溶劑，且溶劑的量為5 mL。

2.1.4 交聯(lián)劑用量的選擇 試驗中模板分子CAP和功能單體DEAEM 的用量固定不變，按照CAP與交聯(lián)劑EGDMA 的摩爾比為1∶0.5、1∶1、1∶2和1∶3，選用不同用量的EGDMA，制備出一系列聚合物，洗脫后測定其吸附量。從表3可見:當CAP 與EGDMA 的摩爾比為1∶1 時，聚合膜的吸附量最大(1.49 μg/孔);隨著EGDMA 用量的增加，聚合膜的吸附量減少，可能是因為交聯(lián)劑用量過多時，導(dǎo)致交聯(lián)太過致密，影響了CAP 分子空穴的形成，同時也由于交聯(lián)致密，導(dǎo)致洗脫困難，洗脫不完全，模板分子殘留在其中，使吸附量降低。所以，本試驗中選用模板分子CAP 與交聯(lián)劑EGDMA的摩爾比為1∶1。

表2 功能單體DEAEM 用量對CAP 聚合膜吸附性的影響Tab.2 Influence of DEAEM amount on adsorption on the imprinted film

表3 交聯(lián)劑EGDMA 用量對CAP 聚合膜吸附性的影響Tab.3 Influence of EGDMA amount on the adsorption on the imprinted film

2.1.5 引發(fā)劑用量的選擇 將模板分子CAP、功能單體DEAEM和交聯(lián)劑EGDMA 按照1∶4∶1 的摩爾比固定不變，采用不同用量的引發(fā)劑AIBN(0.005、0.010、0.020、0.030、0.040 g)制備出一系列CAP 分子印跡聚合膜。結(jié)果表明:當AIBN用量超過0.020 g 時，隨著AIBN 用量的增多，聚合物在孔壁上的形狀不規(guī)則，不具有膜的外觀，而且膜的吸附量也并未增加;但當AIBN 用量過少時，雖然孔里形成的聚合物很整齊，具有膜的外觀，但膜的吸附量明顯降低。這可能是因為引發(fā)劑用量過少時，導(dǎo)致引發(fā)力度過低，聚合反應(yīng)不充分，聚合膜的吸附量也隨之減少。所以，本試驗中選用0.020 g AIBN 來引發(fā)聚合反應(yīng)。

2.1.6 聚合時間的選擇 將聚合物在紫外燈下分別照射4、5、6、12、18、24 h，然后用甲醇乙酸混合液洗脫模板分子。結(jié)果表明:聚合時間越長，模板分子越難洗脫，不僅洗脫時間延長，而且模板分子滲漏嚴重;聚合時間過短時，聚合反應(yīng)不完全，雖洗脫容易，但吸附量明顯減少。所以，本試驗中選用6 h 作為聚合時間。

2.2 CAP 分子印跡聚合膜的吸附性

從圖1可見:隨著CAP 初始濃度的增加，MIP和NIP 對CAP 的吸附量均增加，并且在每一初始濃度下，MIP 要比NIP 的吸附量多;當CAP 初始濃度為120 mg/L 時，MIP 對CAP 的吸附量可達1.51 μg/孔，而NIP 對CAP 的吸附量僅為0.85 μg/孔。

圖1 CAP 分子印跡膜的吸附性Fig.1 Adsorption isotherms of the imprinted and nonimprinted film

2.3 CAP 分子印跡膜的吸附動力學曲線及吸附特異性

從CAP 分子印跡膜對CAP、TAP和FF 3種物質(zhì)的吸附動力學曲線(圖2)可見:印跡膜在20 min 內(nèi)就完成了對CAP 56%的吸附量，在50 min時基本達到吸附平衡;而印跡膜對TAP和FF 也都能吸附，但對FF和TAP 的吸附量均比CAP 少;達到吸附平衡時，印跡膜對CAP 的吸附量為0.83 μg/孔，而對TAP和FF 的吸附量分別僅為0.49、0.40 μg/孔。說明CAP 分子印跡膜對CAP 的吸附具有特異性。

圖2 CAP 分子印跡膜的吸附動力學曲線及吸附特異性Fig.2 Specificity of the chloramphenicol imprinted film

3 結(jié)論

本研究中，在96 孔板上制備了一種CAP 分子印跡膜，通過試驗優(yōu)化了制備條件并測定了該膜的吸附量及吸附特異性。

(1)當模板分子、功能單體DEAEM 與交聯(lián)劑EGDMA 的摩爾比為1∶4∶1，模板分子物質(zhì)的量為0.25 mmol，THF 溶劑的量為5 mL，在100 W 紫外燈下照射6 h 時，制備的CAP 分子印跡膜吸附效果最佳，可在50 min 內(nèi)達到吸附平衡，當CAP 初始濃度為120 mg/L 時，吸附量可達1.51 μg/孔。

(2)吸附特異性試驗結(jié)果表明，當CAP、TAP和FF 的初始濃度為50 mg/L，達到吸附平衡時，印跡膜對CAP 的吸附量為0.83 μg/孔，而對TAP和FF 的吸附量分別為0.49、0.40 μg/孔。說明該膜對CAP 具有專一識別能力。

(3)與生物抗體的難制備相比，此膜用作人工抗體具有生物抗體所不可替代的優(yōu)勢:制備成本低、穩(wěn)定性高、抗惡劣環(huán)境能力強、能重復(fù)使用。

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