謝雯雯，尹 濤，張 晉，劉 茹，趙思明，熊善柏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070）

鈣是人體中含量最多的礦物質(zhì)元素，其代謝平衡對維持人體健康起著至關(guān)重要的作用[1]。我國的膳食營養(yǎng)結(jié)構(gòu)以谷類為主，導致我國居民普遍缺鈣[2]，因此攝食補鈣制劑是預(yù)防和治療鈣缺乏、骨質(zhì)疏松的主要手段。目前主要有無機和有機鈣鹽類、生物骨鈣類等兩大類補鈣制劑，其中無機、有機鈣鹽類包括碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣等，這類鈣制劑存在著水溶性不高、吸收率較低、且對腸胃有一定的刺激性的缺點，在第二類補鈣產(chǎn)品中，有天然生物骨鈣（魚骨鈣、牦牛骨鈣）和螯合鈣制劑（氨基酸螯合鈣）[3-4]。生物骨鈣中，有研究證明微細化魚骨粉具有較高的鈣吸收率和鈣存留率[5]，且顯著高于相應(yīng)劑量的碳酸鈣[6]。

近年來，我國淡水魚加工業(yè)發(fā)展迅速，其中魚糜制品因其具有高蛋白、低脂肪、品種多樣等特點深受消費者歡迎。白鰱是魚糜制品主要的原料之一，其采肉率一般只有25%～30%，采肉剩余的魚骨中含有豐富的鈣、磷等礦物質(zhì)，且其鈣磷比接近人體最佳吸收比例，是一種良好的天然鈣源[7-8]。已有報道證明，鈣制劑的粒徑對其鈣吸收有明顯影響[9-10]，但魚骨粉粒徑對其鈣吸收率影響的研究未見報道，本實驗以采肉剩余的鰱魚中骨為原料，通過酶解制成不同粒徑的魚骨粉，分別與魚蛋白肽混合制備成魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，探究魚骨粉粒徑對魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中鈣的吸收利用率的影響，為利用魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物開發(fā)制備新型補鈣產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購于華中農(nóng)業(yè)大學集貿(mào)市場。

魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，將酶解制得的魚骨粉烘干，經(jīng)不同程度粉碎后過篩，制得小粒徑（d≤74 μm）、中粒徑（d=165～74 μm）和大粒徑（d=833～165 μm）3個粒徑等級的魚骨粉。酶解制得的酶解液經(jīng)濃縮、冷凍干燥并粉碎后制得魚蛋白酶解物（其水解度為25.80%，平均肽鏈長度為2.25個氨基酸），將不同粒徑的魚骨粉分別和魚蛋白酶解物按一定比例混合，制得含有不同粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物（其蛋白質(zhì)含量分別為（28.33±1.07）%、（29.00±0.72）%、（29.87±0.86）%；鈣含量分別為：（25.48±0.06）%、（22.67±0.09）%、（21.75±0.20）%；磷含量分別為（9.57±0.03）%、（9.74±0.03）%、（9.90±0.00）%）。

木瓜蛋白酶（分析純） 美國Sigma公司；實驗中其他化學試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AA-6300C原子吸收儀 日本島津公司；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)分析儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；BS-210型分析天平 德國Sartorius公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；722型可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；游標卡尺（150mm×0.02mm） 上海量具刃具制造廠；Discovery A（S/N86171）骨密度儀 美國Hologic公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼料的配制

動物飼料配方參照AIN-93標準配制[11]，小粒徑組、中粒徑組、大粒徑組飼料的鈣源分別為添加了小粒徑、中粒徑、大粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物。各組飼料配方除鈣源不同外，其他成分均保持一致。動物飼料的配方均為食用級物質(zhì)，均由江蘇特洛菲實驗動物飼料高科技平臺加工制作。小粒徑、中粒徑、大粒徑組大鼠飼料及碳酸鈣對照組、低鈣對照組大鼠飼料中鈣的含量分別為（0.68±0.02）%、（0.67±0.04）%、（0.71±0.03）%、（0.68±0.04）%、（0.23±0.00）%。AIN-93配方中，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素含量分別為20.0%、64.0%、7.0%、3.5%、1.0%，具體成分見表1。

表1 AIN-93配方標準Table 1 The AIN-93 formula standard

1.3.2 動物的分組和飼養(yǎng)

4周齡的Wistar雄性大鼠40只（購于湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號：SCXK（鄂）2008-0005），隨機分為5組[12]，即小粒徑組、中粒徑組、大粒徑組、碳酸鈣對照組和低鈣對照組（即空白對照組），每組8只，在武漢大學動物實驗中心飼養(yǎng)（該中心所有動物實驗設(shè)施和環(huán)境條件符合國家標準），自由進食、飲水，定時更換墊料，每周稱量體質(zhì)量，代謝期收集大鼠糞便和尿液，記錄攝食量，代謝期結(jié)束后采用頸椎脫臼處死法處死大鼠，解剖觀察大鼠內(nèi)臟，收集雙側(cè)股骨。整個實驗過程中保持室內(nèi)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達40%～70%[13]。

1.3.3 動物骨礦物鹽含量的測定

實驗結(jié)束后處死大鼠，取大鼠左側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，采用高溫灼燒稱質(zhì)量法測骨礦物鹽含量。

1.3.4 動物骨密度的測定

實驗結(jié)束后處死大鼠，分離其右側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，用骨密度儀測其骨密度[2]。

1.3.5 動物骨長度的測定

實驗結(jié)束后處死大鼠，取大鼠左側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，用游標卡尺直接量取股骨長度。

1.3.6 鈣含量的測定

采用原子吸收法，參照參考文獻[14]。

1.3.7 磷含量的測定

采用分光光度法，參照參考文獻[15]。

1.3.8 動物鈣表觀吸收率的測定

測定代謝期期間大鼠的鈣攝入量X1，糞便中含鈣量X2，按式（1）計算鈣表觀吸收率[2]。

1.3.9 動物鈣存留率的測定

測定代謝期期間大鼠的鈣攝入量X1、糞便中含鈣量X2、尿液中鈣含量X3，按式（2）計算鈣存留率[16]。

1.3.10 動物骨生物力學指標的測定

實驗動物處死后立即取出試件，剔除骨上的軟組織，將紗布用生理鹽水浸透后，包裹在試件上，放入塑料袋中存放在－20℃的冰箱中，實驗時將其自然解凍。實驗時參數(shù)設(shè)置為：最大荷載20 kg；跨距15 cm；加載速率5 mm/min，加載時，注意試件橫截面短軸方向與加載力方向保持一致，記錄載荷-變形曲線，讀出實驗試件的結(jié)構(gòu)力學指標（最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度、韌性）。

用游標卡尺測量大鼠股骨空心橢圓的外長軸B，空心橢圓的內(nèi)長軸b、空心橢圓的外短軸H、空心橢圓的內(nèi)短軸h。試件長軸壁厚、短軸壁厚、骨皮質(zhì)面積[17]計算分別見式（3）～（5），橫截面對其形心軸的慣性矩、最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、能量吸收計算分別見式（6）～（9）。

測量支座間的距離L，讀出曲線線性范圍內(nèi)相應(yīng)點的載荷P和跨中撓度f，按式（10）計算試件的彈性模量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次，取其平均值，采用Microsoft Excel、SAS軟件進行數(shù)據(jù)處理[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠體質(zhì)量的變化

圖1 實驗期間各組大鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.1 Changes in body weight of rats during the experiment

圖2 實驗期間各組大鼠體質(zhì)量增長總值Fig.2 Gross weight gain of rats during the experiment

實驗期間，各組大鼠生長發(fā)育情況良好，活動正常，飲食穩(wěn)定。每周記錄大鼠的體質(zhì)量，繪得大鼠體質(zhì)量增長曲線如圖1所示。各組大鼠在第1～10生長周期間體質(zhì)量均呈穩(wěn)定上升趨勢，第11生長周后大鼠被移入代謝籠進行代謝實驗，新的環(huán)境對大部分大鼠食欲造成一定的影響，使其攝食量減小，體質(zhì)量降低，因此除低鈣對照組大鼠體質(zhì)量生長正常外，其他4組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量輕微下降的現(xiàn)象，代謝期結(jié)束后，大鼠被移回飼養(yǎng)籠，體質(zhì)量增長恢復(fù)正常。經(jīng)計算，得出實驗期間各組大鼠體質(zhì)量增長總值如圖2所示，低鈣對照組大鼠體質(zhì)量增長總值最大（346.69±41.15）g，中粒徑組大鼠體質(zhì)量增長總值最?。?18.44±34.66）g，但5組大鼠體質(zhì)量增長總值之間不存在顯著性差異，說明魚骨粉的粒徑、鈣制劑的種類和劑量對其能量物質(zhì)的吸收代謝沒有顯著性影響。

2.2 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠內(nèi)臟質(zhì)量的差異

大鼠生長及代謝實驗進行完后，采用斷頸的方法處死大鼠，解剖大鼠，觀察大鼠內(nèi)臟，并分別記錄大鼠的肝、脾、腎的質(zhì)量，求得大鼠肝、脾、腎與處死前大鼠體質(zhì)量的比值，結(jié)果見表2。

表2 不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物對大鼠肝體比、脾體比、腎體比的影響（ ±s,n=8）Table 2 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on liver index,spleen index, kidney index of rats ( ±s,n=8)

表2 不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物對大鼠肝體比、脾體比、腎體比的影響（ ±s,n=8）Table 2 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on liver index,spleen index, kidney index of rats ( ±s,n=8)

注：同列數(shù)據(jù)上標字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同，表示差異不顯著。下同。

組別 肝體比/% 脾體比/% 腎體比/%小粒徑組 4.96±0.18A 0.17±0.01A 1.40±0.05A中粒徑組 4.97±0.16A 0.19±0.02A 1.37±0.16A大粒徑組 4.94±0.14A 0.19±0.03A 1.43±0.18A碳酸鈣對照組 5.07±0.05A 0.20±0.04A 1.34±0.05A低鈣對照組 5.01±0.05A 0.22±0.03A 1.46±0.12A

由表2可知，各組大鼠的肝體比、脾體比、腎體比之間均無顯著性差異（P＞0.05），且大鼠解剖后觀察，未見肝臟、脾、腎臟、肺臟、心臟等器官出現(xiàn)異常，說明各組大鼠均生長正常，未發(fā)生重要器官病變或疾病感染，實驗期間采集的所有數(shù)據(jù)均科學有效。

2.3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異

大鼠代謝期間，按時記錄每只大鼠的攝食量，收集每只大鼠的糞便和尿液，測定各組大鼠的飼料、糞便和尿液中的鈣含量，計算出各組大鼠的鈣表觀吸收率、鈣存留率，結(jié)果見表3。

表3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異（ ±s,n=8）Table 3 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on calcium apparent absorption rate and calcium retention rate of rats ( ±s,n=8)

表3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異（ ±s,n=8）Table 3 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on calcium apparent absorption rate and calcium retention rate of rats ( ±s,n=8)

組別 鈣表觀吸收率/% 鈣存留率/%小粒徑組 47.84±3.90A 44.94±3.01BA中粒徑組 41.33±0.96B 39.75±3.66BC大粒徑組 37.89±2.05BC 37.16±3.07DC碳酸鈣對照組 31.92±3.22B 31.78±5.99D低鈣對照組 50.86±9.00A 50.24±9.29A

由表3可知，在3個實驗組之間，大鼠的鈣表觀吸收率隨著魚骨粉粒徑的減小呈顯著增大趨勢，說明魚骨粉粒徑對魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中鈣的吸收有一定的影響，粒徑減小增大了與消化液的接觸面積，進而提高了大鼠對其的吸收利用率。經(jīng)腸道吸收的鈣進入血液循環(huán)后，大部分會沉積在骨骼中，當血液中鈣濃度降低時，骨骼中的鈣就會釋放出來維持機體鈣平衡[20]，受試大鼠血液中的鈣在實驗期間保持平衡狀態(tài)，因此3個實驗組的鈣存留率變化趨勢同鈣表觀吸收率一致。魚骨中鈣的主要存在形式為羥基磷灰石晶體（Ca10(PO4)6(OH)2）和無定型磷酸氫鈣（CaHPO4），由表3可知，小粒徑組大鼠的鈣表觀吸收率和鈣存留率均顯著高于碳酸鈣對照組，且小粒徑組大鼠飼料和碳酸鈣對照組飼料的鈣含量沒有顯著性差異（分別為（0.68±0.02）%、（0.68±0.04）%），鈣磷比均接近2∶1，說明該粒徑范圍魚骨粉中的羥基磷灰石晶體和無定型磷酸氫鈣經(jīng)酶解后其吸收利用率優(yōu)于同劑量的碳酸鈣。機體對鈣的吸收具有適應(yīng)性，當鈣攝入量過多時，機體對鈣的主動轉(zhuǎn)運過程將會達到飽和，此時鈣主要以被動擴散過程吸收，鈣的吸收率降低，當鈣攝入量較少時，機體主要以主動轉(zhuǎn)運過程完成對鈣的吸收，其鈣吸收率增高[21]。低鈣對照組大鼠的鈣表觀吸收率，鈣存留率均顯著高于其他4組，這可能是由于飼料中的鈣含量較低，機體對鈣的攝入量長期不足，機體對鈣的吸收主要以主動轉(zhuǎn)運過程為主，導致對鈣的吸收也會顯著增加。

2.4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異

實驗結(jié)束后，將大鼠處死，取出大鼠右側(cè)股骨，去除其結(jié)締組織后測各組大鼠股骨的濕骨質(zhì)量、干骨質(zhì)量、骨密度、礦物鹽含量、骨鈣含量和骨磷含量，結(jié)果見表4。

表4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 4 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the physical and chemical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

表4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 4 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the physical and chemical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 濕骨質(zhì)量/g干骨質(zhì)量/g骨密度/（g/cm2）礦物鹽含量/% 骨鈣含量/% 骨磷含量/%小粒徑組 1.04±0.11A0.67±0.08A 0.28±0.02A 65.62±0.64A24.18±0.01A0.97±0.00A中粒徑組 1.05±0.12A0.69±0.08A 0.26±0.01BA 64.28±0.85B23.93±0.01A0.81±0.00A大粒徑組 1.01±0.06A0.67±0.04A 0.26±0.00BA 64.17±0.80B21.21±0.01B0.81±0.00A碳酸鈣對照組1.03±0.07A0.66±0.05A 0.28±0.01A 64.31±0.17B23.39±0.02A0.87±0.00A低鈣對照組 1.05±0.03A0.66±0.03A 0.25±0.02B 62.32±1.27C17.84±0.01C0.87±0.00A

骨骼的生長發(fā)育過程表現(xiàn)為一定程度的骨量增加或保持骨量[22]，由表4可知，各實驗組和對照組之間濕骨質(zhì)量、干骨質(zhì)量都不存在顯著性差異，說明各組大鼠骨骼發(fā)育正常。骨密度和骨礦物鹽含量的測量是評價骨質(zhì)量的最好方法，間接用于評價鈣的營養(yǎng)狀況[23]，低鈣對照組大鼠股骨骨密度、骨礦物鹽含量和骨鈣含量均顯著低于其他4組，說明魚骨粉和碳酸鈣中的鈣均有較好的沉積效果，有利于骨密度的增加。隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的骨密度、骨礦物鹽含量和骨鈣含量均增大，其中大粒徑組大鼠和中粒徑組大鼠股骨的骨密度和骨礦鹽含量差異沒有顯著性，中粒徑組大鼠和小粒徑組大鼠股骨的骨鈣含量差異沒有顯著性。小粒徑組大鼠與碳酸鈣對照組大鼠股骨的骨密度和骨鈣含量同處于最高水平，說明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉和碳酸鈣中鈣的沉積效果相同，對應(yīng)大鼠的骨營養(yǎng)情況均較好。各組大鼠股骨磷含量沒有顯著性差異，說明魚骨粉的粒徑，鈣源的種類以及鈣的攝入量對大鼠股骨磷含量的影響不顯著。

2.5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨力學性質(zhì)的差異

表5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)的差異（ ±s,n=8）Table 5 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structure of the rat femur ( ±s,n=8)

表5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)的差異（ ±s,n=8）Table 5 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structure of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 長軸壁厚/mm 短軸壁厚/mm 骨皮質(zhì)面積/mm2小粒徑組 1.12±0.08A 0.78±0.08A 5.52±0.44A中粒徑組 0.81±0.08B 0.66±0.08BA 4.89±0.43BA大粒徑組 0.72±0.05B 0.63±0.05B 5.17±0.4BA碳酸鈣對照組 1.03±0.12A 0.76±0.12BA 4.97±1.86BA低鈣對照組 0.82±0.07B 0.63±0.07B 4.38±0.71B

骨標本的結(jié)構(gòu)力學性質(zhì)與其形狀大小有關(guān)[17]，皮質(zhì)骨越薄，骨組織總量越小，越容易發(fā)生骨質(zhì)疏松癥或骨折[24]，因此實驗樣本的長、短軸厚度及骨皮質(zhì)面積可以反映樣品的強度和剛度。由表5可知，隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的長、短軸壁厚均呈上升趨勢，小粒徑組大鼠股骨的長、短軸壁厚，骨皮質(zhì)面積均高于其他粒徑組和碳酸鈣對照組、低鈣對照組，說明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉更有利于大鼠股骨的生長發(fā)育，骨皮質(zhì)厚度和骨皮質(zhì)面積的增加，使大鼠股骨強度和剛度較好，發(fā)生骨折的概率相對較小。

表6 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學性質(zhì)的差異（±s,n=8）Table 6 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structural mechanical properties of the rat femur (±s,n=8)

表6 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學性質(zhì)的差異（±s,n=8）Table 6 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structural mechanical properties of the rat femur (±s,n=8)

組別 最大載荷/kg 最大撓度/mm 能量吸收/（kg·mm） 彈性載荷/kg 彈性撓度/mm小粒徑組 15.33±0.65A 1.58±0.10A 7.52±0.48A 9.48±6.33A 1.19±0.03A中粒徑組 11.05±0.62B 1.39±0.06B 4.71±0.33B 9.57±0.53B 0.99±0.07B大粒徑組 13.18±2.55BA 1.44±0.05BA 4.15±0.48CB 9.02±0.84CB 0.92±0.04CB碳酸鈣對照組 11.48±1.16B 1.42±0.18BA 3.78±0.31C 8.76±0.67CB 0.86±0.01C低鈣對照組 10.98±0.64B 1.40±0.04B 3.62±0.4C 8.38±0.36C 0.86±0.06C

由表6可知，小、中、大粒徑組大鼠其股骨最大載荷和最大撓度隨著魚骨粉粒徑的減小雖存在明顯差異，但并未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，能量吸收隨著魚骨粉粒徑的減小，對應(yīng)實驗組大鼠股骨的能量吸收呈顯著上升趨勢，其中小粒徑組大鼠股骨的最大載荷、最大撓度和能量吸收均顯著高于其他粒徑組，以及碳酸鈣對照組和最低水平的低鈣對照組，說明小粒徑組大鼠股骨的骨骼力學強度最大，發(fā)生骨折的幾率相對最低。低鈣對照組大鼠由于長期缺鈣，股骨結(jié)構(gòu)疏松，致使股骨抗壓能力減小，容易發(fā)生骨折。

隨著魚骨粉粒徑的減小，對應(yīng)實驗組大鼠股骨彈性撓度呈顯著上升趨勢，說明魚骨粉的粒徑對大鼠股骨彈力性質(zhì)有一定影響，小粒徑魚骨粉對增強大鼠股骨彈力性質(zhì)的效果最佳，且優(yōu)于碳酸鈣對照組，因此小粒徑組大鼠的股骨在外力負荷作用下不易發(fā)生塑性變形，產(chǎn)生不可逆損傷的幾率也相對較小[23]。在所有受試大鼠中，低鈣對照組大鼠股骨的彈性載荷和彈性撓度均最低，說明魚骨粉和碳酸鈣對大鼠股骨彈力性質(zhì)都有增強作用，其中魚骨粉的效果更佳。

表7 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨材料力學性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 7 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the material mechanical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

表7 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨材料力學性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 7 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the material mechanical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 骨截面慣性矩/mm4 最大應(yīng)力/（kg/mm2）彈性應(yīng)力/（kg/mm2）彈性模量/（kg/mm2）韌性/（g/mm）小粒徑組 7.48±0.44A 12.35±0.79BA 10.17±4.87A 98.08±4.87B 8.25±1.41A中粒徑組 5.53±0.43B 11.63±1.20B 10.06±19.39A124.98±19.39BA 7.99±0.27A大粒徑組 4.91±0.40B 15.13±2.62A 10.42±18.13A141.55±18.13A 8.66±1.28A碳酸鈣對照組 6.29±1.86BA 11.16±2.92B 8.45±35.96A120.97±35.96BA10.06±1.87A低鈣對照組 5.57±0.71B 11.62±0.91B 8.89±15.19A124.31±15.19BA 8.12±0.59A

由表7可知，隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的骨截面慣性矩呈上升趨勢，說明魚骨粉的粒徑對大鼠股骨骨量圍繞骨中軸的分布狀態(tài)有顯著影響，魚骨粉粒徑越小，對應(yīng)受試大鼠股骨骨結(jié)構(gòu)分布離中心越遠，骨結(jié)構(gòu)力學性能越優(yōu)[23-25]。彈性模量隨魚骨粉粒徑減小呈下降趨勢，即魚骨粉粒徑越小，對應(yīng)受試大鼠股骨對變形的阻力越小。魚骨粉的粒徑對大鼠股骨無機鹽質(zhì)量的影響沒有一定規(guī)律，因此對應(yīng)受試大鼠股骨的最大應(yīng)力的變化未呈現(xiàn)一定規(guī)律。5組大鼠間股骨的彈性應(yīng)力及韌性均無顯著性差異，表明魚骨粉的粒徑，鈣源的種類以及鈣的攝入量對受試大鼠股骨有機相質(zhì)量沒有顯著性影響[24]。小粒徑組大鼠股骨的骨截面慣性矩、最大應(yīng)力顯著大于碳酸鈣對照組，表明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉對受試大鼠股骨無機相的形成和骨量分布的優(yōu)化優(yōu)于碳酸鈣。

3 討 論

我國市場上的補鈣產(chǎn)品種類繁多，近幾年來，鈣制劑在品種、處方組成、劑型及鈣鹽合成方面均有很大的發(fā)展，有學者以Wistar大鼠為模型，研究了市場上具有代表性的碳酸鈣制劑和氨基酸螯合鈣制劑的吸收率和骨骼效應(yīng)[2]，發(fā)現(xiàn)在同等水平鈣攝入量的情況下，氨基酸螯合鈣組的鈣吸收率達到了65.80%，顯著高于對應(yīng)劑量碳酸鈣組的49.43%（P＜0.05），這可能是由于氨基酸螯合鈣屬于復(fù)合補鈣產(chǎn)品，其中的VD含量（200 IU/g）高于碳酸鈣（156 IU/g），促進了鈣的主動吸收，氨基酸螯合鈣中的多種氨基酸，促進了鈣的被動吸收所致。也有學者研究了淡水魚骨粉的補鈣效果，結(jié)果表明淡水魚骨粉具有較高的鈣吸收率（63.42%）和鈣存留率（60.70%），且通過臨床實驗證明其糾正缺鈣的效果優(yōu)于一般鈣劑[5]。王曉峰等[26]研究比較了納米螯合鈣、蘋果酸枸櫞酸鈣、L-天冬氨酸鈣、牦牛骨鈣、牛骨鈣、珊瑚鈣、魚骨鈣、碳酸鈣共8種鈣劑對大鼠鈣吸收率的影響，結(jié)果表明，8種飼料鈣水平相同的鈣劑，其鈣吸收率與鈣儲留率并無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著高于低鈣組（P＜0.05），說明元素鈣在體內(nèi)的吸收率受不同鈣劑的物理性質(zhì)和化學形式的影響不大。

合理選擇鈣制劑，需要綜合考慮鈣制劑的鈣含量、吸收率、安全性及性價比等因素。盡管市場上的補鈣產(chǎn)品的種類繁多，但碳酸鈣仍然是目前應(yīng)用最廣的補鈣制劑，新型補鈣產(chǎn)品氨基酸螯合鈣也逐漸受到消費者的歡迎。本實驗制備的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，其鈣含量為23.30%左右，低于碳酸鈣（40.8%）[26]，與市售的樂力氨基酸螯合鈣含量相當（23.25%）；蛋白質(zhì)含量為29.07%左右，顯著高于碳酸鈣和樂力氨基酸螯合鈣（14.00%）；鈣表觀吸收率為47.84%左右，高于碳酸鈣（31.92%），低于樂力氨基酸螯合鈣（50.40%）[7]。魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物是經(jīng)酶解、濃縮、干燥和物理粉碎獲得，魚骨上剩余的蛋白質(zhì)被水解成小分子質(zhì)量肽和氨基酸，有利于機體對蛋白質(zhì)的吸收利用，且水解產(chǎn)物中含有一定量的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，具有降血壓的活性[27]。相比與氨基酸螯合鈣的制備工藝，魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物省去了氨基酸溶解、加金屬鹽、螯合反應(yīng)、有機溶劑沉淀產(chǎn)物、分離等工序[28]，反應(yīng)條件易控制，工藝簡單，產(chǎn)率高，產(chǎn)物安全。本實驗證明了魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物鈣吸收利用率隨魚骨粉粒徑減小而增大的規(guī)律，在工業(yè)化生產(chǎn)中可考慮進一步將魚骨粉進行納米化，獲得粒徑更小的魚骨粉，用以制備粉劑或者片劑的補鈣產(chǎn)品。

4 結(jié) 論

魚骨粉的粒徑對大鼠的體質(zhì)量、肝體比、脾體比、腎體比無顯著影響（P＞0.05），對魚骨粉-魚蛋白肽混合鈣的鈣吸收利用率有顯著影響（P＜0.05）。隨著魚骨粉粒徑的減小，對應(yīng)受試大鼠的鈣表觀吸收率、鈣存留率、骨密度、骨礦物鹽含量、骨皮質(zhì)面積、股骨能量吸收等均呈顯著增大的趨勢，在添加了大、中、小3種粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中，添加粒徑≤74 μm魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物各項評價指標均顯著高于其他實驗組和碳酸鈣對照組及低鈣對照組，其鈣表觀吸收率為（47.84±3.90）%，鈣存留率為（44.94±3.01）%，骨鈣含量為（24.18±0.01）%，能量吸收為（7.52±0.48）kg·mm，其鈣生物利用率最高。

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