李 蘭，雷曉冬

（河南科技學院 生物工程系，河南 新鄉(xiāng) 453003）

淀粉酶活性常量與微量測定方法比較

李 蘭，雷曉冬

（河南科技學院 生物工程系，河南 新鄉(xiāng) 453003）

以實驗室保存的淀粉酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過平板分離、點種、碘熏蒸，篩選出產(chǎn)淀粉酶活力較高的菌株。本實驗重點采用常量測定法和微量測定法對酶活性進行測定，并對所得數(shù)據(jù)進行比較分析，結果顯示，兩種方法測定的酶活性差異不明顯，說明微量測定法是可以代替常量測定法的。

枯草芽孢桿菌；淀粉酶；DNS；常量測定；微量測定

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，能夠水解淀粉分子，生成包括糊精在內的不同水解產(chǎn)物，并逐步生成由葡萄糖單位組成的聚合物。微生物的許多種類都能產(chǎn)生淀粉酶，枯草芽孢桿菌是其中主要生產(chǎn)菌種之一。淀粉酶是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種。特別是20世紀60年代以來，由于酶法生產(chǎn)葡萄糖以及用葡萄糖生產(chǎn)異構糖漿的大規(guī)模工業(yè)化，淀粉酶的需要量越來越大，幾乎占到整個酶制劑總產(chǎn)量的50%。目前淀粉酶被廣泛應用于多個領域，因此，做好淀粉酶活性測定工作具有重要意義。

測定α-淀粉酶活性的方法有分光光度法、應交擴散法、3，5-二硝基水楊酸法、黏度計法和降落值法。目前，3，5-二硝基水楊酸法是最常用的方法。在大多數(shù)測定淀粉酶的實驗和標準中，都是采用常規(guī)的方法和步驟，試劑用量較大，且操作過程不夠簡便。本實驗選用的產(chǎn)淀粉酶菌株是實驗室保存的枯草芽孢桿菌，經(jīng)過平板分離、點種、碘熏蒸，篩選出淀粉產(chǎn)酶活性較高的菌株；通過常量和微量兩種方法分別測定淀粉酶活性，并對測定結果進行比較分析，希望可以提供一種能夠代替常量測定的經(jīng)濟、有效、簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

實驗室試管保存的枯草芽孢桿菌。

1.1.2 試劑

檸檬酸緩沖液（pH 6.0），0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，1%淀粉溶液，3，5-二硝基水楊酸（DNS），標準葡萄糖溶液（1 g/L）。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH 6.5。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏1%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉5%，牛肉膏1%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，氯化鈣1%，pH 6.5。

1.1.4 儀器

722N可見分光光度計，101A-2電熱鼓風干燥箱，恒溫水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，YPW-Ⅰ型迴轉式恒溫調速搖瓶柜，80-1離心沉淀器，凈化工作臺，JA5002電子天平，蒸汽消毒器，電爐，電磁爐等實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的篩選及保存

1.2.1.1 菌種的篩選

將試管保存的制備枯草芽孢桿菌成菌懸液，分別稀釋10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7倍，

各取1 mL涂布于平面上，分別置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。在濃度適當?shù)呐囵B(yǎng)基上選取15個菌株，分別編號，轉接于試管斜面，于37℃下培養(yǎng)24 h，置冰箱保存。然后用接種針分別蘸取每個菌落點種在已經(jīng)滅過菌的平板上，37℃下培養(yǎng)24 h。用碘熏蒸培養(yǎng)皿，在菌落周圍出現(xiàn)水解圈，測量水解圈直徑與菌落直徑并計算其比值（HC比值），作為篩選指標。

1.2.1.2 菌種的保存

選取酶活性較高的菌株，將冰箱中保存的相應菌株接種于20支試管斜面上，37℃下培養(yǎng)24 h，然后保存在4℃冰箱中。

1.2.2 淀粉酶活性的常量、微量測定

1.2.2.1 粗酶液制備

從冰箱中取出保存的菌株，轉接試管斜面活化，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h。將菌種挑取三環(huán)接種到30/250 mL種子培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，培養(yǎng)12 h。用移液管吸取3 mL接種到30/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液3500 r/min離心10min，去上清液，即為粗酶液。

1.2.2.2 酶促反應

每一個樣品4支試管，一個做對照，其他用于測定樣品（3個平行樣）；每管加入酶液1 mL，向各管中加入檸檬酸緩沖液（pH 6.0）1 mL，然后再向對照管中加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，以終止其中的酶促反應，各管均是在60℃水浴15 min；分別向各試管中加入60℃水浴預熱15 min的1%淀粉溶液，搖勻，立即放回水浴中，準確保溫10 min；迅速向各測定管中加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，以終止酶促反應。每一步加入試劑的用量見表1。

表1 常量和微量酶促反應的試劑用量對比

1.2.2.3 顯色反應

待測樣：取上述酶促反應液于試管中，加入3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5 min。取出冷卻，蒸餾水稀釋。利用可見分光光度計測定520 nm下的吸光度。其中，常量試劑中，酶促反應液和DNS各2.0 mL，稀釋至24 mL；微量試驗中，2種試液分別加入0.5 mL，稀釋至6 mL；標準液：取7支試管，分別加入葡萄糖標準液（1 g·L－1），再向各試管中加水定容。然后加入3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5 min。取出冷卻，蒸餾水稀釋。利用紫外可見分光光度計測定520 nm下的吸光度。標準樣常量和微量顯色反應的實際用量見表2。

表2 標準樣常量和微量顯色反應的實際用量對比

1.2.2.4 樣品中葡萄糖含量的計算

以標準樣中葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程。將待測樣的吸光度代入方程，求得待測樣的葡萄糖含量，折算成1 mL粗酶液中葡萄糖的含量及酶活力。淀粉酶活力＝濃度×體積×1000×稀釋倍數(shù)/時間。其中，濃度單位為g/L，酶活力單位為μg/min。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選結果

篩選了5株產(chǎn)酶活性較高的菌株，分別為枯草6，枯草8，枯草11，枯草13，枯草14，其水解圈直徑（H）與菌落直徑（C）比值見表3。

表3 5株枯草芽孢桿菌菌落水解圈直徑與菌落直徑比值

由表3可以看出，枯草13菌株形成的比值最大，產(chǎn)酶活力較高，因此選定枯草13作為篩選結果。

2.2 淀粉酶活性常量和微量測定結果

2.2.1 標準曲線在常量和微量方法中的對比

以葡萄糖為標準樣進行顯色反應，常量測定法和微量測定法所測的吸光值及標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)見表4。

標準曲線試驗方法規(guī)定，R2相關系數(shù)達到0.99的回歸方程才可使用。從表4可以看出，采用常量和微量試驗方法建立的標準曲線，其相關系數(shù)均在0.99以上。說明采用微量法獲得的標準曲線是可以利用的。

表4 標準曲線的常量和微量對比

2.2.2 采用常量和微量法測定待測樣品結果對比

常量標準曲線回歸方程：

y＝1.416x－0.054（R2相關系數(shù)為0.999）

微量標準曲線回歸方程：

y＝1.374x－0.054（R2相關系數(shù)為0.999）

以每個樣品3次重復為樣品，做3個平行。對其進行淀粉酶活性測定。具體實驗結果見表5和表6。

常量、微量法測定的酶活力比較見表7。

由表7無法確定測定方法的差異，因此對兩種方法所測酶活力進行方差分析，見表8。

表5 待測樣在常量試驗中的數(shù)據(jù)分析

表6 待測樣在微量試驗中的數(shù)據(jù)分析

表7 常量、微量法測定酶活力的比較

表8 常量、微量法測定酶活力結果方差分析

由表8可以看出，F(xiàn)＝0.77＜F0.05＝4.49，說明兩種測定方法之間不存在明顯差異，同時也可以判定這種差異是由實驗誤差引起的，不存在本質差異。因此，微量方法是可以代替常量方法進行淀粉酶活力測定的。

3 小結

從測定結果來看，微量測定法和常量測定法存在差異，但是差異不顯著，因此可以用微量測定法代替常量測定法對淀粉酶活性進行測定，從而節(jié)約藥品用量，降低測定成本。

［1］權淑靜，馬煥，解復紅，等.淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.河南科學，2011，29（10）：1185－1189.

［2］柳輝，楊江科，閆云君.產(chǎn)α-淀粉酶菌株的分離、鑒定及酶學性質研究［J］.生物技術，2007，17（2）：34－37.

［3］張龍翔，張挺芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.2版.北京：高等教育出版社，1997：463.

［4］王俊麗，聶國興，曹香林，等.不同DNS試劑測定木糖含量的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（7）：1－4.

［5］崔秀珍.試驗統(tǒng)計與分析［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2009.

［6］管斌，謝來蘇，丁友芳，等.枯草芽孢桿菌α-淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學學報，1997，23（5）：88－92.

［責任編輯：鄧 渝］

Com parison between the M ethods for Constant M easurement and M icro Determ ination of Am ylase Activity

LILan，LEIXiao-dong
（Department of Bioengineering，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

The bacterium bacillus subtiliswhich was produced from amylase and kept in the laboratory was treated as the starting strain.The strain with higher production of amylase was screened through the flat panel separation，dibbling and iodide fumigation.This experiment used the constants determination and the micro determination to determine the amylase activity and the data was analyzed by comparative analysis.The result showed that the difference of two methods for the determination of enzyme activity was not apparent，which proved that micro determination method could replaced the constant determination method.

bacillus subtilis；amylase；DNS；constantmeasurement；micro determination

Q946.5

A

1006－8481（2014）04－0033－05

2014－05－06

李蘭（1972—），女，河南科技學院生物工程系高級實驗師。