季 紅，高 青，胡先同，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

·綜述·

經(jīng)典Wnt信號通路在心肌細胞分化作用的研究進展*

季 紅，高 青，胡先同，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

Wnt信號；干細胞；心肌分化

缺血性心臟病已成為發(fā)達國家的主要死因，并有著驚人的發(fā)病率[1]。急性心肌梗死后，心臟自我更新能力有限及重構(gòu)導(dǎo)致左室功能下降[2]。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）在40年前被首次從骨髓中分離出來，并且成為細胞心肌成型術(shù)的主要種子細胞之一。以其獨特的優(yōu)勢如易于分離、擴增，同種異體移植時無免疫原性以及多向分化潛能等受到普遍關(guān)注[3-5]。

1 經(jīng)典Wnt信號的作用機制

經(jīng)典Wnt信號是通過卷曲蛋白（FZD）受體和低密度脂蛋白相關(guān)蛋白共受體（LRP5/LRP6）形成的復(fù)合物傳至β-catenin信號級連系統(tǒng)[6-7]。在Wnt信號缺失的時候，β-catenin與結(jié)腸癌息肉蛋白（APC）和軸蛋白（AXIN）形成復(fù)合物，被酪蛋白激酶（CK1α）和糖原合酶激酶（GSK3β）磷酸化其NH2基末端，進而由βTRCP1或βTRCP2復(fù)合物泛素化通過蛋白酶體途徑降解[8]。當Wnt蛋白連接到Frizzled家族受體，相關(guān)下游組件散亂蛋白（Dvl）被CK1α磷酸化，從而與FART緊密結(jié)合，誘導(dǎo)FZD-DVL復(fù)合體與LRP5/6-AXIN-FRAT復(fù)合體的組[9-10]，β-catenin被CK1α和GSK3β磷酸化后釋放，不斷累積，進入核內(nèi)，核內(nèi)的β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）和Legless-PYGO復(fù)合物結(jié)合，激活目的基因如FGF20、DKK1、WISP1、MYC、CCND1的轉(zhuǎn)錄[11-14]。

2 Wnt信號通路的調(diào)控

分泌性卷曲相關(guān)蛋白（SFRP）和Wnt抑制因子1（WIF1）是一類可溶性因子，直接連于WNT分子，以將其與膜結(jié)合受體隔開，相反，DDK家族成員與LRP共受體緊密連接，而使Wnt受體復(fù)合物破壞，最近發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路可受到一些細胞內(nèi)介質(zhì)的影響。如DAPPER1/FRODO1（DACT1）蛋白與散亂蛋白（Dishevelled）相互作用而抑制來自FZ/LRP受體復(fù)合物的信號傳導(dǎo)。此外，經(jīng)典Wnt信號在核內(nèi)可被chibby和chop蛋白拮抗，這些因子與LEF或TCF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制Wnt目的基因的表達。

3 Wnt信號對胚胎心臟發(fā)生、發(fā)育的作用

近年來對多能胚胎癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt經(jīng)典途徑促進心肌分化。說明此途徑可能隨著時間的變化起到雙相調(diào)節(jié)作用。Shuichi等[15]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎中，持續(xù)過表達β-catenin通路的配體Wnt11則增加心肌的分化，也就是說Wnt11通過β-catenin途徑可以誘導(dǎo)心臟形成。相反地，晚期激活βcatenin信號則降低心肌分化。而早期用Wnt 3a處理分化的鼠胚胎干細胞可以激活中胚層的誘導(dǎo)，促進心肌分化，與此同時激活一個反饋環(huán)路，從而在后期抑制Wnt途徑,控制心肌發(fā)展的大小。從時間上劃分，即在原胚腸期之前，Wnt/β-catenin通路促進心肌分化，在原胚腸期則抑制心臟的形成。

Wnt/β-catenin信號在哺乳動物心臟形成早期同樣被激活，并對其心肌發(fā)育起著不可或缺的作用。Teruya等[16]用1%二甲基亞砜（DMSO）誘導(dǎo)鼠多能細胞系P19CL6后，發(fā)現(xiàn)早、晚期心臟基因均被上調(diào)，并出現(xiàn)自發(fā)搏動，而Wnt3A和Wnt8A較最早出現(xiàn)的心臟基因還要提前幾天，DMSO誘導(dǎo)使Wnt信號分子β-catenin增加，而Frizzled-8/Fc可抑制這種作用，從而抑制對心臟轉(zhuǎn)錄因子、心臟生長因子和肌球蛋白重鏈的誘導(dǎo)。同樣，Wnt/β-catenin的抑制劑GSK也可以抑制這種分化。而用Wnt3A和GSK的抑制劑氯化鋰可明顯上調(diào)Nkx2.5、GATA4、MEF2C、Tbx5、α-MHC的表達，并提高心肌分化細胞的比例。

4 Wnt/β-catenin通路在MSCs向心肌分化中的作用

MSCs由于其體外易于分離、擴增、遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點，可能成為目前細胞治療首選的干細胞模型。研究證明MSCs在體內(nèi)外均可分化為肌細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細抱、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞，并可在體外克隆擴增超過100萬倍仍然保留多系分化能力[17-20]。

目前Wnt信號對MSCs向心肌分化中的作用還不十分清楚，過去認為Wnt信號可以通過非經(jīng)典通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）向心肌細胞分化[21-22]，而Wnt/β-catenin通路抑制心肌分化，Jaeyeaon等[23]發(fā)現(xiàn)5氮胞苷（5－Aza）可誘導(dǎo)MSCs表達Nkx2.5、α-MHC、cTNI，而GSK3β上調(diào)，β-catenin下調(diào)，GSK3β的抑制劑LiCl、SB 216743和BIO可阻斷這種作用，表示GSK-3通過下調(diào)β-catenin誘導(dǎo)MSCs心肌分化。

但越來越多的實驗表明，Wnt信號對MSCs的心肌分化作用同樣具有雙相性。Zelarayan等[24]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路在間充質(zhì)細胞向心肌分化早期被激活，然而心肌細胞后期的分化卻需要下調(diào)βcatenin。

5 Wnt/β-catenin通路在心臟修復(fù)中的作用

實驗表明，在各種動物心肌梗死后可誘導(dǎo)多種Wnt分子及經(jīng)典途徑的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子如disheveled和β-catenin[25-26]。Omonigho等[27]發(fā)現(xiàn)在正常鼠成體心臟中，經(jīng)典Wnt信號的活性被局限在血管和血管周圍以及瓣膜間質(zhì)，而在冠狀動脈結(jié)扎后，Wnt信號的活性就出現(xiàn)明顯增強。相比較其對于心臟發(fā)育特定階段的作用，經(jīng)典途徑在心肌梗死的作用可能由于特定細胞及激活和抑制的時間性而有所不同。如大鼠心肌梗死后，過表達Wnt信號抑制劑分泌型frizzled相關(guān)蛋白（sFRP1,sFRP2）可改善心臟功能，減少枉死面積，減少心臟破裂[28]。而大鼠心梗模型內(nèi)，腺病毒介導(dǎo)的Wnt經(jīng)典途徑的主要激動劑βcatenin的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可引起梗死面積的減少。提示經(jīng)典Wnt信號促進心臟損傷的修復(fù)[29]。

6 中醫(yī)藥誘導(dǎo)MSCs分化對Wnt信號通路的影響

近年來，許多研究已經(jīng)表明，某些中藥復(fù)方制劑、單味中藥或中藥提取物能有效誘導(dǎo)干細胞分化，且無明顯毒副作用，張錦芳等[30]用淫羊藿黃酮（FA）誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化時，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路中β-cantenin及其靶基因cyclinD均明顯上調(diào)，而抑制劑DKK在一定程度抑制了FA誘導(dǎo)的成骨分化作用。華聲瑜等[31]在實驗中證明丹酚酸B聯(lián)合5-aza可明顯增強Desmin和α-actin mRNA的表達。范英昌等[32]研究也證明了丹酚酸B能夠促進骨髓基質(zhì)細胞向心肌樣細胞分化，但是，其深入機制尚不清楚。在丹酚酸B聯(lián)合多種方法誘導(dǎo)MSCs向心肌細胞分化的同時，檢測的經(jīng)典Wnt信號通路中關(guān)鍵物質(zhì)β-catenin、GSK-3β的表達變化，發(fā)現(xiàn)此通路在向心肌分化時受到抑制。

綜上所述，Wnt信號機制在心臟發(fā)生、發(fā)育、分化、修復(fù)等過程中均起著重要作用，但由于受體物種、移植細胞種類、內(nèi)環(huán)境、作用時段不同，這些作用錯綜復(fù)雜，有時甚至看似矛盾，了解Wnt信號機制為促進BMSCs向心肌分化，以及細胞移植治療心肌梗死提供理論依據(jù)。

[1] Lloyd-Jones D,Adams RJ,Brown TM,et al.Executive summary:heart disease and stroke statistics[J].Circulation，2010，121:948-954.

[2]Pfeffer MA,BraunwaldE.Ventricularremodelingaftermyocardial infarction:experimental observations and clinical implications[J].Circulation，1990，81:1161-1172.

[3] Friedenstein AJ,Chailakhjan RK,Lalykina KS.The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guineapig bone marrow and spleen cells[J].CellTissueKinet，1970, 3:393-403.

[4] Lennon DP,Caplan AI.Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Exp Hematol，2006，34:1604-1605.

[5] Uccelli A,Moretta L,Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health anddisease[J].Nat Rev Immunol，2008，8:726-736.

[6] Bhanot P,Brink M,Samos CH,et al.A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor[J].Nature，1996，382:225-230.

[7] Pinson KI,Brennan J,Monkley S,et al.An LDL receptorrelated protein mediates Wnt signalling in mice[J].Nature，2000，407:535-538.

[8] Price MA.CKI,there’s more than one:casein kinase IfamilymembersinWntandHedgehogsignaling[J].GenesDev，2006，20:399-410.

[9] Wong HC,Bourdelas A,Krauss A,et al.Direct binding of the PDZ domain of Dishevelled to a conserved internal sequence in the C-terminal region of Frizzled[J].Mol Cell，2003，12: 1251-1260.

[10]Tolwinski NS,Wehrli M,Rives A,et al.Wg/Wnt signal can be transmitted through arrow/LRP5,6 and Axin independently of Zw3/Gsk3h activity[J].Dev Cell，2003，4:407-418.

[11]Chamorro MN,Schwartz DR,Vonica A,et al.FGF20 and DKK1 are transcriptional target of β-catenin and FGF20 is implicated in cancer and development[J].Embo，2005，24: 73-84.

[12]Pennica D,Swanson TA,Welsh JW,et al.WISP genes are members of the connective tissue growth factor family that are upregulated in Wnt1-transformed cells and aberrantly expressed in human colon tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:14717-14722.

[13]He TC,Sparks AB,Rago C,et al.Identification of c-MYC as a target of the APC pathway[J].Science，1998，281:1509-1512.

[14]Tetsu O,McCormick F.β-Catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells[J].Nature，1999,398: 422-426.

[15]Shuichi U,Gilbert W,Tomoaki O.Biphasic role for Wnt/βcatenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells[J].Pnas，2007,104(23)：9685-9690.

[16]Teruya N,Motoaki S,Zhou S,et al.A Wntand β-catenindependent pathway for mammalian cardiac myogenesis[J].Pnas，2003,100（10）：5834-5839.

[17]Roekop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopetic tissues[J].Science,1997,276(53):71-74.

[18]Sanehez-Ramos J,Song S,Cardozo-pelaze F，et al.Adult bone Marrow stromal eells differentiatein to neuraleells in vitro[J].Exp Neurol,2000,164(2):247.

[19]Nuttall ME,Patton AJ,Olivera DL,et al.Human trabecular bone Cells are able to express both osteoblastic and adipocytic phenype:implications for osteogenic disorders[J].J Bone Miner Res,1998,13(3):371.

[20]Bruder SP,Jaiswal N,Haynesworth SE.Growth kintics，selfrenewal，and the osteogenic potential of purified human mesenchmal stem cells during extensive subeultivation and following cryopreservation[J].Cell Bioehem，1997,64(2): 278-294.

[21]Belema-Bedada F,Technau A,Ebelt H，et al.Activation of myogenic differentiation pathways in adult bone marrowderived stem cells[J].Mol Cell Biol,2005,25(21):9509-9519.

[22]Schulze M,Belema-Bedada F,Technau A，et al.Mesenchymal stem cells are recruited to striated muscle by NFAT/IL-4-mediated cell fusion[J].Genes Dev,2005,19 (15):1787-1798.

[23]Jaeyeaon C,Pranela R,Junichi S.Distinct roles of glycogen synthase Kinase(GSK)-3αandGSK-3β in mediating cardiomyocyte differentiation in murine bone Marrow-derived mesenchymal stem cells[J].The Journal of Biological Chemistry,2009,284(52)：36647-36658.

[24]Zelarayan L,Gehrke C,Bergmann MW.Role of β-catenin in adult cardiac remodeling[J].Cell Cycle,2007,17(6):2120-2126.

[25]Blankensteijn WM,Gijn ME,Essers-Janssen YPG,et al.Beta-catenin,an inducer of uncontrolled cell proliferation and migration in malignancies,is localized in the cytoplasm of vascular endothelium during neovascularization after myocardial infarction[J].Am J Pathol，2000，157：877-883.

[26]Barandon L，Dufourcq P,Costet P,et al.Involvement of FrzA/sFRP-1 and the Wnt/Frizzled pathway in ischemic preconditioning[J].Circ Res，2005，96：1299-1306.

[27]Omonigho A,Meena R,Sergey R.Experimental myocardial infarction triggers canonical Wnt signaling and endothelialto-mesenchymal transition[J].Disease Models&Mechanisms，2011,4：469-483.

[28]Kobayashi K,Luo M,Zhang Y,et al.Secreted Frizzledrelated protein 2 is a procollagen C proteinase enhancer with a role in fibrosis associated with myocardial infarction[J].Nat Cell Biol，2009，11：46-54.

[29]Hahn JY,Cho HJ,Bae JW，et al.β-catenin overexpression reduces myocardial infarct size through differential effects on cardiomyocytes and cardiac fibroblasts[J].Biol Chem，2006，281：30979-30989.

[30]張錦芳,謝偉東,張雅鷗.淫羊藿黃酮誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中Wnt信號通路的研究 [J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2010,10(6):1006-1009.

[31]華聲瑜,范英昌,馬軼文,等.丹酚酸B對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化過程中Desmin、α-actinmRNA表達的影響[J].天津中醫(yī)藥,2009,26(2):145-148.

[32]范英昌,華聲瑜,姚雅娟.丹酚酸B誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細胞向心肌樣細胞分化的研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，24(1):10-13.

R542.2

：A

：1673－9043（2014）04－0246-03

2014-03-30）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.16

天津市自然科學(xué)基金項目（09JCYBJC12200）。

季 紅（1976-），女，碩士研究生，研究方向為干細胞及心血管疾病研究。

范英昌，E-mail:fych@tjutcm.edu.cn。