周 軍

(天津市藥品檢驗(yàn)所,天津 300070)

水蛭的研究進(jìn)展*

周 軍

(天津市藥品檢驗(yàn)所,天津 300070)

水蛭為《中國(guó)藥典》2010年版收載的動(dòng)物藥，其為水蛭科動(dòng)物螞蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(HinudenipponicaWhitman)或柳葉螞蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥體[1]。水蛭為活血消癥藥，具有破血通經(jīng)，逐瘀消瘕的功效；用于血瘀經(jīng)閉，癥瘕痞塊，中風(fēng)偏癱，跌撲損傷。中醫(yī)在治療因瘀血所致的疾病中廣泛使用水蛭，近年發(fā)現(xiàn)水蛭在治療腦缺血性疾病和癌癥方面療效確切。同時(shí)，隨著科學(xué)水平的提高，對(duì)水蛭的質(zhì)量控制研究逐步深入，建立了包括水蛭中蝶啶類(lèi)活性成分、總多糖、可溶性蛋白質(zhì)、磷脂、次黃嘌呤等成分的含量測(cè)定方法；此外，為從DNA分子水平對(duì)水蛭和螞蟥進(jìn)行區(qū)分，建立和優(yōu)化水蛭ISSR-PCR反應(yīng)體系。本文對(duì)近年水蛭藥材的藥理作用及質(zhì)量研究狀況進(jìn)行總結(jié)，為水蛭的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

水蛭，藥理作用，含量測(cè)定，質(zhì)量控制

水蛭俗名螞蟥、馬鱉，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)，蛭綱，顎蛭目，水蛭科，在陸地淡水環(huán)境生長(zhǎng)繁殖，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥。《中國(guó)藥典》2010年版一部收載水蛭藥材的基源共有3種，分別為水蛭科動(dòng)物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HinudenipponicaWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥體[1]。中醫(yī)認(rèn)為，水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消瘕的作用；在臨床用于血瘀經(jīng)閉，癥瘕痞塊，中風(fēng)偏癱，跌撲損傷等病癥。水蛭的藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)臨床應(yīng)用具有悠久的歷史，尤其在治療因瘀血所致的疾病中被廣泛使用。近年發(fā)現(xiàn)，水蛭在治療腦缺血性疾病和癌癥方面療效確切。本文對(duì)近年水蛭藥材的藥理作用及質(zhì)量研究狀況進(jìn)行總結(jié)，為水蛭的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 藥理作用研究的進(jìn)展

1.1對(duì)腦缺血的影響 水蛭功效為破血逐瘀消癥，是中醫(yī)治療腦缺血病要藥，臨床療效確切。研究表明[2],微粉水蛭能夠降低腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，降低丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平，降低細(xì)胞間黏附分子(ICAM)水平，提高超氧化物歧化酶(SOD)活力，水蛭微粉高、中組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于粗粉組。水蛭微粉高組大鼠腦組織中的MDA、血清中的ICAM水平明顯低于粗粉組，說(shuō)明水蛭能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷。

1.2對(duì)S180腫瘤及血管新生的影響 水蛭中特有的水蛭素活性因子具有極強(qiáng)的抗凝血作用，利于藥物進(jìn)入肌體病變組織內(nèi)抑制和殺死腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，水蛭素活性因子可以延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間，提高細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。

1.3水蛭抑制腫瘤血管生成的作用及其機(jī)制 實(shí)驗(yàn)表明，水蛭能通過(guò)改善腫瘤缺氧微環(huán)境抑制腫瘤血管生成來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制可能是通過(guò)降低HIF-1α蛋白水平和mRNA的表達(dá)，以及降低由低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)α所介導(dǎo)的靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4]。

1.4水蛭可抑制腎小球系膜細(xì)胞增生 研究發(fā)現(xiàn)，水蛭可抑制腎小球系膜細(xì)胞的增生，其機(jī)制為：①水蛭單藥及其與黃芪組合均可降低血清生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移因子-β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原(Col-IV)和纖維連接蛋白(FN)的含量；試驗(yàn)證明，水蛭可以劑量依賴(lài)地抑制大鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM Cs)產(chǎn)生Col-Ⅳ，且作用效果明顯好于黃芪；②水蛭可通過(guò)阻止大鼠系膜細(xì)胞(HBZY-1)由Go/G期向s期進(jìn)展，抑制系膜細(xì)胞的增殖[5]。

2 質(zhì)量控制研究的進(jìn)展

2.1RP-HPLC測(cè)定水蛭中3種蝶啶類(lèi)活性成分 采用RP-HPLC測(cè)定水蛭中3種活性成分水蛭甲素、水蛭乙素、水蛭丙素的含量。以甲醇-0.05%三氟乙酸水溶液(20∶80)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm。測(cè)定結(jié)果顯示，不同來(lái)源的水蛭藥材中上述3種成分的含量差異較大[6]。

2.2分光光度法測(cè)定水蛭中可溶性蛋白質(zhì)的含量 水蛭是動(dòng)物類(lèi)藥材，而蛋白質(zhì)為動(dòng)物藥材中的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，其可溶性蛋白的含量可以在一定程度上反應(yīng)藥材的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以牛血清蛋白為對(duì)照物，考馬斯亮藍(lán)G-250顯色，采用分光光度法，測(cè)定水蛭藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量[7]。

2.3分光光度法測(cè)定水蛭藥材中總多糖的含量 本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為對(duì)照物，苯酚-硫酸試劑顯色，采用分光光度法，對(duì)水蛭藥材中總多糖含量進(jìn)行測(cè)定，從一定程度上可以評(píng)價(jià)水蛭藥材的質(zhì)量[8]。

2.4水蛭抗凝血活性成分的研究 本研究采用血漿復(fù)鈣時(shí)間為指標(biāo)，對(duì)從水蛭中分得3個(gè)抗凝血活性多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)和分子量測(cè)定，結(jié)果表明，上述3個(gè)成分相對(duì)分子質(zhì)量均在1萬(wàn)以下，都屬于糖蛋白類(lèi)[9]。

2.5中藥水蛭經(jīng)炮制后的成分變化研究 實(shí)驗(yàn)研究了水蛭經(jīng)炮制后，氨基酸和甾體類(lèi)成分組成的變化情況，以求為水蛭的炮制方法提供一定的化學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中采用HPLC-柱后衍生化法測(cè)定了水蛭炮制后氨基酸組成的變化[10]。

2.6水蛭簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(ISSR-PCR)反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 水蛭種類(lèi)較多，分布較廣，不同種之間的藥用效果具有明顯差異。因此，從分子水平上對(duì)水蛭進(jìn)行研究，為水蛭的開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)指導(dǎo)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定了水蛭ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，同時(shí)用10份水蛭個(gè)體對(duì)最佳體系進(jìn)行了穩(wěn)定性驗(yàn)證[11]。

2．7HPLC測(cè)定水蛭仿生酶解有效部位中次黃嘌呤及尿苷 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體消化過(guò)程，對(duì)水蛭藥材先以胃蛋白酶酶解、再以胰蛋白酶酶解的仿生酶解方法；最后以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，采用HPLC同時(shí)測(cè)定水蛭中次黃嘌呤及尿苷的含量[12]。

2．8螞蟥和水蛭種間遺傳變異和系統(tǒng)關(guān)系的ITS序列分析 運(yùn)用ITS 測(cè)序分析我國(guó)不同地區(qū)螞蟥W pigra、水蛭H nipponia核糖體ITS堿基序列差異，用MEGA 4.0軟件中的MP法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)對(duì)螞蟥、水蛭ITS基因片段遺傳特征的研究發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)變異很小，在14個(gè)群體中有45個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換。MP系統(tǒng)樹(shù)將14個(gè)種群螞蟥和水蛭分為兩大類(lèi)群[13]。

2．9水蛭藥材中總磷脂含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)以磷酸二氫鉀為對(duì)照物，鉬藍(lán)試劑顯色，采用分光光度法測(cè)定水蛭藥材中總磷脂的含量[14]。

2．10柱前衍生HPLC法測(cè)定水蛭中氨基酸的含量 實(shí)驗(yàn)用異硫氰酸苯酯衍生化法，使水蛭的氨基酸與異硫氰酸苯酯反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰衍生物，采用HPLC法測(cè)定水蛭中水解及游離的6種氨基酸：L-谷氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸的含量[15]。

中醫(yī)臨床使用的藥物中，水蛭在治療中風(fēng)、高血壓、血瘀、閉經(jīng)、跌打損傷等方面具有顯著的療效。隨著對(duì)水蛭研究的不斷深入，其在治療嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的心腦血管疾病和癌癥等疾病方面，顯示出巨大的優(yōu)越性和廣闊的前景。

1 中國(guó)藥典[S]．一部.2010:77

2 李克明，武繼彪，隋在云.微粉水蛭對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2011，27(4):56-57

3 牟忠祥，任青華，張博.水蛭素活性因子對(duì)S180腫瘤及血管新生的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40(2):40-42

4 李小菊，盧宏達(dá)，陳衛(wèi)群.水蛭抑制腫瘤血管生成的作用及其機(jī)制[J].腫瘤防治研究，2013，40(1):46-50

5 郭會(huì)敏，翟文生.黃芪、水蛭、雷公藤多甙對(duì)系膜增生性腎小球腎炎作用機(jī)理的現(xiàn)代研究[J].河南中醫(yī)，2010，30(6):611-612

6 鄭云楓，程建明，彭國(guó)平.RP-HPLC測(cè)定水蛭中3種蝶啶類(lèi)活性成分的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(6):573-574

7 丁冠華，李峰，康廷國(guó).水蛭地龍藥材商品中可溶性蛋白質(zhì)的含量測(cè)定[J].遼寧中醫(yī)雜志，2010，37(6):1100-1101

8 丁冠華，李峰，康廷國(guó).水蛭地龍藥材商品中總多糖含量測(cè)定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(5):986-987

9 鐘山，楊得坡，崔征.水蛭抗凝血活性成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(23):2781-2784

10 劉麗芳，金蓉鸞，徐國(guó)鈞，等.中藥水蛭經(jīng)炮制后的成分變化研究[J].中成藥，2001，23(12):880-882

11 張香東，劉庚，常素慧，等.水蛭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].中草藥，2013，44(2):215-218

12 王艷，楊培民，代龍，等.HPLC測(cè)定水蛭仿生酶解有效部位中次黃嘌呤及尿苷[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(13):74-76

13 劉飛，郭巧生，史紅專(zhuān)，等.螞蟥和水蛭種間遺傳變異和系統(tǒng)關(guān)系的ITS序列分析[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(4):414-419

14 丁冠華，李峰，康廷國(guó).水蛭地龍藥材商品中總磷脂含量測(cè)定[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(4):36-37

15 劉陽(yáng)，謝誼，易艷，等.柱前衍生HPLC法測(cè)定水蛭、地龍中氨基酸的含量[J].湖南中醫(yī)雜志，2012，28(3):138-139

2013-05-24

R965

A

1006-5687(2014)04-0050-02