趙 爽，鄭華川，趙恩宏，鄭 鑫，肖麗君,高野康雄

胃腸道癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。雖然最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，世界范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率呈降低趨勢，但我國胃癌的發(fā)病總數(shù)占世界胃癌發(fā)病總數(shù)的47%，在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第三位[1-2]。在胃腸道癌的發(fā)生發(fā)展過程中，抑癌基因的失活，內(nèi)環(huán)境的改變，凋亡受阻等因素可能起到重要作用。HRPT2基因是一種抑癌基因，其編碼的Parafibromin蛋白可與PAF1形成復(fù)合體，再通過蛋白-DNA相互作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而誘導(dǎo)細胞凋亡或抑制細胞增殖[3-5]。在人體多種惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)Parafibromin蛋白表達異常，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。

本研究采用大樣本量，以免疫組化的方法觀察Parafibromin蛋白在胃腸道癌中的表達，旨在探討Parafibromin蛋白在胃腸道癌發(fā)生發(fā)展中的作用及與胃腸道癌臨床病理特征的相關(guān)性，為胃腸道癌預(yù)后的判斷及臨床治療提供理論和參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取1997年12月—2008年12月日本富山大學(xué)醫(yī)學(xué)部手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為胃腸道癌的患者814例，其中男523例，女291例；年齡18～99歲，平均66.3歲；312例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。術(shù)前患者均未接受放療、化療或生物治療，均獲得患者及其家屬知情同意和日本富山大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 材料收集 收集所有胃腸道癌患者癌組織標(biāo)本814份，同時收集胃腸道癌患者癌旁組織標(biāo)本328份及腺瘤組織標(biāo)本129份。標(biāo)本均取自首次切除病灶的患者。

1.3 主要試劑 Parafibromin鼠抗人多克隆抗體(購自美國Santa Cruz公司)，羊抗鼠單克隆HRP抗體(購自DaKo公司)，抗原修復(fù)液、牛血清清蛋白(購自美國Sigma公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 病理學(xué)鑒定 組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，切片厚4 μm。HE染色確定其組織學(xué)特征；Lauren分型確定腫瘤分化特征；彈性纖維染色和D2-40染色鑒別靜脈和淋巴管浸潤、UICC分期。同時收集患者腫瘤直徑和其余一般臨床資料。

1.5 組織芯片構(gòu)建 腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋，HE染色進行形態(tài)學(xué)觀察，核對組織及有關(guān)病理診斷，并在組織切片和相應(yīng)標(biāo)本蠟塊上進行標(biāo)記。在標(biāo)記的相應(yīng)位置用組織芯片取樣器(KIN-1，日本AZUMAYA公司)取樣，將鉆取的組織塊放入標(biāo)記好的24陣列固定塑料框架中注蠟包埋。切取4 μm切片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫組織化學(xué)法 采用免疫組化染色(SP)法檢測Parafibromin蛋白表達，石蠟切片脫蠟脫水，微波修復(fù)抗原15 min，滴加5%牛血清清蛋白到切片上，室溫孵育15 min；Parafibromin一抗工作液按1∶100稀釋后使用，以不加一抗的樣品作為陰性對照，一抗4 ℃保濕過夜；羊抗鼠單克隆抗體工作液按1∶100稀釋后使用，二抗室溫保濕孵育1 h；DAB顯色，在顯微鏡下控制染色時間，水洗終止反應(yīng)；蘇木精染色1 min后水洗，80 ℃溫水去除蘇木精非特異染色；無水乙醇脫水2次，15～30 min/次；二甲苯透明2次，30 min/次；中性樹膠封片。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判定 200倍光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野，以細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞占視野比例<5%為陰性(-)；陽性細胞占視野比例5%～25%為弱陽性(+)；陽性細胞占視野比例26%～50%為中等陽性(++)；陽性細胞占視野比例>50%為強陽性(+++)。染色結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師分別閱片診斷核實。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以相對數(shù)表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法；危險因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Parafibromin蛋白在胃腸道組織中的表達 棕黃色深染區(qū)或顆粒樣深染區(qū)位于細胞核，Parafibromin蛋白表達陽性率在胃腸道癌組織、腺瘤組織及癌旁組織中分別為48.9%(398/814)、78.3%(101/129)和92.7%(304/328)。胃腸道癌組織中的Parafibromin蛋白表達陽性率低于腺瘤組織和癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=189.20、47.50，P<0.05，見圖1、表1)。

注：A為胃癌旁組織，B為胃腺瘤組織，C為胃癌組織，D為腸道癌旁組織，E為腸道腺瘤組織，F(xiàn)為腸道癌組織

圖1 胃腸道組織中Parafibromin蛋白的表達(SP，×200)

2.2 Parafibromin蛋白表達陽性與臨床病理特征的關(guān)系 Spearman等級相關(guān)分析顯示，Parafibromin蛋白表達陽性與腫瘤直徑、淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、靜脈侵襲無相關(guān)性(P>0.05，見表2)。

2.3 Parafibromin蛋白表達與臨床預(yù)后的關(guān)系 電話隨訪573例胃腸道癌患者，失訪241例。生存時間為0.2～146.4個月，平均42.1個月。Kaplan-Meier法建立生存曲線顯示，Parafibromin蛋白表達陰性患者累積生存率低于Parafibromin蛋白表達陽性患者(χ2=32.60，P<0.05，見圖2)。利用Cox回歸法建立多因素生存分析模型顯示，年齡≥60歲、腫瘤直徑≥4.5 cm、有淋巴管侵襲 、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期是胃腸道癌死亡的獨立危險因素(P<0.05)，而Parafibromin蛋白表達陽性是胃腸道癌死亡的保護因素(P<0.05，見表3)。

表2 Parafibromin蛋白表達陽性與臨床病理特征的關(guān)系

Table2 Correlation between Parafibromin expression positive and clinicopathological features

臨床病理特征例數(shù)Parafibromin蛋白表達- + ++ +++陽性率(%)rs值 P值年齡(歲)0.0550.118 <6025413539503046.8 ≥60560281898011049.8性別0.0390.261 男523265758210149.3 女29115153483948.1腫瘤直徑(cm)-0.198<0.001 <4.543518669829857.2 ≥4.537923059484239.3靜脈侵襲*-0.0480.173 有69535410610912649.1 無1106119181244.5淋巴管侵襲*-0.134<0.001 有537253889110552.9 無26616237343339.1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移*-0.238<0.001 有491210799111157.2 無31220346352834.9UICC分期*-0.244<0.001 Ⅰ～Ⅱ期35514158589860.3 Ⅲ～Ⅳ期40724859613939.1

注：*表示病例資料有缺失

圖2 胃腸道癌Parafibromin蛋白表達陽性和陰性患者生存曲線

Figure2 Survival curves of Parafibromin expression positive and negative in gastrointestinal cancer patients

3 討論

Parafibromin是一種核內(nèi)表達的蛋白，由抑癌基因HRPT2編碼合成。HRPT2位于人染色體1q31.2，由17個外顯子構(gòu)成，全長18.5 kb。Parafibromin蛋白包含531個氨基酸，分子量為60 kD[3-4]。Parafibromin蛋白調(diào)節(jié)的靶基因在癌癥的增殖、凋亡及分化等方面起著重要作用，因此Parafibromin蛋白在惡性腫瘤中的表達及臨床意義引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也成為研究的熱點問題之一。多個學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Parafibromin蛋白在人體正常組織中具有較高的表達水平，而在甲狀旁腺癌、腎細胞癌及乳腺癌中均表達下降[5-12]。研究證實，Parafibromin蛋白在胃癌及結(jié)腸癌組織中表達下降，參與了胃腸道癌的發(fā)生[13-14]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，Parafibromin蛋白的表達在胃腸道癌組織中低于癌旁組織和腺瘤組織，且其表達陽性與腫瘤直徑、淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期呈負(fù)相關(guān)，與患者性別、年齡及靜脈侵襲無關(guān)。以上結(jié)果均提示Parafibromin蛋白與胃腸道癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。

表3 影響胃腸道癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

Table3 Multivariate Cox regression analysis on influencing factors for gastrointestinal cancer patients

臨床特征OR(95%CI)P值年齡(≥60歲)1.589(1.194,2.113)0.001性別(男)1.078(0.817,1.423)0.595腫瘤直徑(≥4.5cm)1.407(1.037,1.908)0.028靜脈侵襲(有)1.317(0.951,1.825)0.098淋巴管侵襲(有)1.925(1.445,2.565)<0.001淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有)2.621(1.867,3.679)<0.001UICC分期(Ⅲ～Ⅳ期)1.564(1.067,2.292)0.022Parafibromin蛋白表達(+～+++)0.611(0.463,0.806)<0.001

Rozenblatt-Rosen等[3]研究發(fā)現(xiàn)，Parafibromin蛋白可與剪切多聚腺苷酸化特異性因子(CPSF)、剪切刺激因子(CstF)以偶對蛋白(symplekin)形成復(fù)合物后啟動mRNA前體斷裂和多聚腺苷酸(polyA)聚合進而誘導(dǎo)mRNA成熟，增強整合體復(fù)合物亞基6蛋白(INTS6)表達后促進細胞周期G1阻滯。近年研究表明，Parafibromin蛋白與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HAT)形成復(fù)合物后將其甲基化組蛋白H3K4召集至細胞周期調(diào)控因子(Cyclin D1)啟動子，復(fù)合物再與Cyclin D1的啟動和編碼區(qū)結(jié)合抑制Cyclin D1蛋白表達，導(dǎo)致細胞周期阻滯和細胞克隆形成降低[15]。有文獻報道，Parafibromin蛋白可抑制c-myc 啟動子活性且降低其蛋白穩(wěn)定性，c-myc蛋白表達降低導(dǎo)致細胞增殖抑制[16]。c-myc蛋白表達升高不但促進細胞增殖，而且可提高細胞凋亡敏感性。c-myc蛋白還可通過提高Cyclin D1-Cdk4/Cdk6的親和性促進細胞G1/S期轉(zhuǎn)換[17]。Zheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細胞中，過表達Parafibromin蛋白可導(dǎo)致細胞周期阻滯，抑制細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，隨著腫瘤直徑的增大，Parafibromin蛋白的表達呈下降趨勢，提示在胃腸道癌發(fā)生發(fā)展過程中，Parafibromin蛋白抑制細胞增殖作用可能在逐漸減弱。Selvarajan 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌Parafibromin蛋白表達下調(diào)與淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期相關(guān)。Zheng等[14]在胃癌中也發(fā)現(xiàn)Parafibromin蛋白表達與淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Parafibromin蛋白表達與患者性別、年齡及靜脈侵襲無關(guān)，而與UICC分期、淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Parafibromin蛋白表達陽性率在有淋巴管侵襲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腸道癌組織低于無淋巴管侵襲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腸道癌組織，提示Parafibromin蛋白表達下降可能是促進癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的一個重要因素。Cox回歸分析顯示，年齡≥60歲、腫瘤直徑≥4.5 cm、有淋巴管侵襲 、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期是胃腸道癌死亡的獨立危險因素，而Parafibromin蛋白表達陽性是胃腸道癌死亡的保護因素。本研究隨訪573例胃腸道癌患者，發(fā)現(xiàn)Parafibromin蛋白表達陰性患者累積生存率低于Parafibromin蛋白表達陽性患者，進一步證實Parafibromin蛋白表達與胃腸道癌的預(yù)后密切相關(guān)。 綜上所述，Parafibromin蛋白表達下調(diào)參與了胃腸道癌的發(fā)生，且與癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Parafibromin蛋白表達陽性可作為獨立的良好預(yù)后指標(biāo)。相信隨著研究的不斷深入，Parafibromin蛋白將在腫瘤的診斷、預(yù)防和治療等方面成為重要的靶標(biāo)分子。

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