孫彩云，柳鳳娟

（1.河北聯(lián)合大學(xué)輕工學(xué)院[1]，河北唐山063000；2.天津華堪礦業(yè)選冶技術(shù)開發(fā)有限公司，天津301900）

磨盤柿葉總黃酮的提取研究

孫彩云1，柳鳳娟2

（1.河北聯(lián)合大學(xué)輕工學(xué)院[1]，河北唐山063000；2.天津華堪礦業(yè)選冶技術(shù)開發(fā)有限公司，天津301900）

采用乙醇法和半仿生法提取磨盤柿葉總黃酮，乙醇法最佳提取工藝：70%乙醇為溶劑，固液比為1∶10，回流時間為1h，提取溫度為70℃。半仿生法最佳提取工藝：提取溫度80℃，時間1h，固液比為1∶20。

磨盤柿葉；黃酮；半仿生提取

柿葉是柿屬植物柿的葉片，柿子在我國各地普遍栽培，大約有40多種，京津唐地區(qū)主要以磨盤柿聞名。柿果、柿蒂、柿花、柿葉、柿根皮均可入藥?，F(xiàn)代科學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，柿葉除含有相當可觀的蛋白質(zhì)、氨基酸及多種維生素（Vc可達1800mg/100g，遠高于常見的水果和蔬菜）外，還有膽堿、黃酮甙、蘆丁和丹寧，具有抗菌、消炎、活血、降壓、降脂、抗癌、去黃褐斑作用[1]，可廣泛開發(fā)用于食品、藥品和化妝品。我國柿葉資源豐富，從柿葉提取黃酮可變廢為寶，提高其開發(fā)利用價值。常用的提取方法為乙醇浸提法。半仿生提取法[2，3]是模仿口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運過程，為經(jīng)消化道的中藥試劑設(shè)計的一種提取工藝。根據(jù)仿生學(xué)原理，人體胃、小腸、大腸的體液pH值分別為0.9～1.5、7.6、8.3～8.4。半仿生法采用不同pH值的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取，其目的是盡可能地提取和保留原藥中的有效成分。本文采用兩種方法提取黃酮，優(yōu)化提取工藝，為其開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原料磨盤柿葉（采集于河北遵化，干燥、粉碎，過40目篩備用）。

蘆丁（BR，含量≥95%）、NaOH、HCl、無水乙醇、NH4·H2O、NH4Cl，以上均為分析純；AB-8大孔樹脂。

752紫外-可見分光光度計（杭州，1cm石英比色皿）；HH-8恒溫數(shù)顯水浴鍋（江蘇）；BS124S電子天平（北京）；DELTA320酸度計（成都）。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇提取法稱取2g柿葉粉，加入一定量乙醇溶液，在水浴中進行回流提取，提取液定容至相同體積，采用分光光度法進行定量分析，分別考察乙醇濃度、固液比、溫度、時間等對磨盤柿葉總黃酮提取的影響，并采用正交試驗優(yōu)化提取工藝。

1.2.2 半仿生提取法稱取2g柿葉粉，依次加入pH值約為2.0的HCl溶液，pH值約為7.5和8.5的NH3NH4Cl緩沖溶液作為提取液，在一定的溫度下回流提取一定時間，合并3次提取液，用70%乙醇定容至150mL，搖勻，準確吸取1.0mL稀釋至50mL，以70%乙醇做參比，在λmax處測定其吸光度。選取提取溫度，提取時間，料液比等3因素，進行正交實驗設(shè)計，優(yōu)選半仿生法提取工藝條件。

2結(jié)果與討論

2.1 蘆丁紫外吸收曲線和標準曲線

分別吸取50μg·mL-1的蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于5支10mL比色管中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白作參比，在近紫外區(qū)繪制吸收曲線和標準曲線。

磨盤柿葉黃酮提取液經(jīng)AB-8大孔樹脂純化（大孔樹脂的預(yù)處理及純化方法參考文獻[4]法），在近紫外區(qū)掃描吸收曲線。

圖1 蘆丁和磨盤柿葉黃酮紫外吸收曲線Fig.1Ultravillet asorption curve of rutin and mopanpersimmon leaves flavonoids

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2Standard curve of rutin

蘆丁和磨盤柿葉黃酮均在272nm有最大吸收，故選擇272nm作為檢測波長，標準曲線回歸方程為：A=33.3C+0.0295，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，蘆丁濃度在0～0.025mg·mL-1范圍內(nèi)線性較好，可據(jù)此進行定量分析。

2.2 乙醇法提取磨盤柿葉總黃酮的工藝條件

2.2.1 乙醇濃度對磨盤柿葉黃酮提取率的影響稱取2g柿葉粉于錐形瓶中，按固液比1∶10，分別加入不同濃度的乙醇溶液，于60℃水浴回流提取1h，濾液用70%乙醇定容至50mL。準確吸取1.0mL稀釋至50mL，以溶劑為參比，在272nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對提取黃酮的影響Fig.3Effect of alcohol concentration to extract flavoniods

由圖3可知，A值隨著乙醇濃度增大而增大，當乙醇濃度為70%時，A值最大。在提取過程中觀察到提取液中葉綠素的含量也隨著乙醇濃度的增大而一直增大，80%乙醇提取液呈綠棕色，故選擇最佳乙醇濃度為70%。

2.2.2 提取溫度對吸光度的影響稱取2g柿葉粉于錐形瓶中，按固液比1∶10，加入70%乙醇溶液，分別在不同溫度水浴回流提取1h，濾液用70%乙醇定容至50mL，準確吸取1.0mL稀釋至50mL，以溶劑為參比，在λmax272nm下測定其A值，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對黃酮提取效果的影響Fig.4Effect of temperature to extract flavoniods

由圖4可知，提取液A值隨著提取溫度的增大而增大，當提取溫度為60℃時，A值最大，70℃后A值有所降低，較適宜提取溫度范圍為60～80℃。

2.2.3 提取時間對吸光度的影響準確稱取2g柿子葉粉于錐形瓶中，按固液比1∶10，加入70%乙醇溶液，于60℃水浴中分別回流提取不同時間，濾液用70%乙醇定容至50mL。準確吸取1.0mL稀釋至50mL，以溶劑為參比，在272nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間對黃酮提取效果的影響Fig.5Effect of alcohol concentration to extract flavoniods

由圖5可知1.5～2h范圍A值較大，1h時A值偏低不多，2.5h之后A值又降低，為節(jié)省能源選擇提取時間為1h。

2.2.4 固液比對吸光度的影響稱取2g柿葉粉于錐形瓶中，分別按不同固液比加入70%乙醇，于60℃水浴中回流時間1h，過濾，濾液用70%乙醇定容至50mL，準確吸取1.0mL稀釋至50mL，以溶劑為參比，在272nm處測定其A值，結(jié)果見圖6。

圖6 固液比對提取液吸光度的影響料液比Fig.6Eeffect of solid-to-liquid ratio to extract flavoniods

由圖6可見固液比1∶10以上時，A值較大，增長趨勢變緩，為節(jié)省試劑，選擇地固液比為1∶10。2.2.5正交實驗結(jié)果根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，乙醇回流提取法中影響柿葉總黃酮提取效果的因素有回流溫度、回流時間、乙醇濃度、固液比，選用L9（34）正交表進行正交試驗，結(jié)果見表1。

由表1可見最優(yōu)組合為A3B1C2D2，即：70%乙醇，回流時間1h，提取溫度70℃，固液比為1∶10。影響因素的主次順序為回流溫度＞回流時間＞乙醇濃度＞固液比。經(jīng)驗證在此條件下每百克柿葉粉可得黃酮1.18g。但70%乙醇提取液中葉綠素含量較高，溶液黃綠色，不利于黃酮的精制。

表1 乙醇提取法正交實驗結(jié)果Tab.1Orthogonal experiment result of alcohol extraction

2.3 半仿生法正交實驗結(jié)果

表2 半仿生法正交實驗結(jié)果Tab.2Orthogonal experiment result of semi-bionic extraction

最優(yōu)組合為A3B2C3，即：固液比為1∶20，提取溫度80℃，時間1h。影響因素主次順序為固液比＞回流時間＞溫度。經(jīng)驗證在此條件下每百克柿葉粉可得黃酮1.62g，且半仿生法提取液中脂溶性雜質(zhì)少，溶液棕黃色，葉綠素含量明顯低于乙醇提取法，但水溶性雜質(zhì)會高于乙醇提取法。

3結(jié)論

（1）通過單因素實驗和正交實驗，確定了乙醇提取法最佳提取工藝條件：乙醇濃度為70%，回流時間1h，提取溫度70℃，固液比1∶10。影響因素的大小順序為：回流溫度＞回流時間＞乙醇濃度＞固液比。在此條件下總黃酮得率1.18g/100g柿葉粉。

（2）運用半仿生法對磨盤柿葉黃酮進行了提取，用pH值分別為2.0、7.5和8.5的水溶液為提取溶劑各提取一次，通過正交實驗確定最佳提取工藝條件為：提取溫度80℃，時間1h，固液比為1∶20。影響因素主次順序為：固液比＞回流時間＞溫度。在此條件下總黃酮得率1.62g/100g柿葉粉，高于乙醇提取法，且提取液中葉綠素含量低，有利于精制。

［1］蘇東海,吳穹,何淑芳,等.柿葉中黃酮提取工藝的研究［J］.食品科學(xué),2005,26（增刊）:39-42.

［2］陳叢瑾,黃克瀛,李德良.正交試驗法優(yōu)選香椿葉總黃酮的半仿生提取工藝［J］.食品科技,2007，（6）:119-121.

［3］龐中磊,唐文.柚皮總黃酮半仿生提取工藝研究［J］.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）,2012,12（1）:6-9.

［4］貝偉劍,彭文烈,羅杰.柿葉黃酮的大孔吸附樹脂分離提純富集［J］.中成藥,2005,27（3）:257-261.

Extraction of total flavonoids from Mopan persimmon leaves

SUN Cai-yun1，LIU Feng-juan2
（1.Qinggong College,Heibei United University,Tangshan 063000,China；2.Tianjin North China Mining Mineral Smelting and Technology Development Company,Tianjin 301900,China）

The total flavonoids from Mopan persimmon leaves was separately extracted by alcohol extraction method and semi-bionic extraction method.The optimum extraction conditions of alcohol extraction:70%alcohol as solvent,solid-liquid ratio of 1∶10,refluxing time 1h,extraction temperature 70℃.The optimum extraction conditions of semi-bionic extraction:extraction temperature 80℃,time 1h,solid-liquid ratio of 1∶20.

Mopan persimmon leaves；flavonoids；semi-bionic extraction

R284.2

A

1002-1124（2014）02-0067-04

2013-11-20

孫彩云（1972-），女，河北遵化人，碩士，講師，主要從事天然物提取及檢測研究。