宋文秀， 盧飛艷， 王艷萍， 吳曉媚

(1.廣東省珠海市遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院兒科，廣東 珠海 519100)

新生兒缺氧缺血性腦病是圍生期神經(jīng)病學(xué)中的一個重要的問題，部分存活者有腦性癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重影響了人口素質(zhì)。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSC)是終身具有增殖和分化能力的細(xì)胞，可以分化為多種神經(jīng)細(xì)胞，而Nestin是鑒定NSC的重要標(biāo)記。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GbE)對治療心腦血管疾病及缺血性腦病等有一定療效，但具體機制尚未完全清楚。本實驗針對HIBD大鼠在GbE治療前后Nestin蛋白表達(dá)的變化進行研究，以此探討GbE對新生大鼠HIBD的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 銀杏葉提取物 由萬榮三九藥業(yè)提供的舒血寧注射液，每支含總黃酮醇苷1.68 mg，銀杏內(nèi)酯0.28 mg。

1.1.2 Nestin試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 7 d齡SD大鼠 懷孕的SD大鼠由廣東省實驗動物中心提供，在我院動物室喂養(yǎng)至產(chǎn)下新生SD大鼠，SD大鼠由母鼠喂養(yǎng)，第7天的大鼠為新生7 d的SD大鼠。SD大鼠母鼠生產(chǎn)前及產(chǎn)后飲食飼料由廣東省實驗動物中心提供。實驗室溫度控制在18℃～22℃。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 采用隨機數(shù)字表法，將72只新生7 d的SD大鼠分為假手術(shù)組、NS治療組、GbE治療組3組。

1.2.2 HIBD動物模型制備方法 首先使用5%丙戊酸鈉將SD大鼠麻醉，然后切開頸部皮膚，分離出右側(cè)頸總動脈，并用雙線將其兩端結(jié)扎，然后剪斷右側(cè)頸總動脈，縫合切口、皮膚。術(shù)后新生鼠恢復(fù)2 h后放入8%氧氣和92%氮氣混合的缺氧艙內(nèi)2 h后取出，放回母鼠身邊繼續(xù)飼養(yǎng)。

假手術(shù)組: 切開頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，然后縫合皮膚，擦干血跡放回母鼠身邊繼續(xù)飼養(yǎng)。

銀杏葉治療組: 在HIBD術(shù)后30 min向小鼠腹腔注射銀杏葉提取物(舒血寧注射液)。首劑25 mg/kg，以后每12 h 1次(分別于每天早晨8∶00及夜間20∶00)，直至取材。

NS治療組: HIBD術(shù)后30 min腹腔注射等量NS(注射方法及時間與銀杏葉治療組相同)，直至取材。

1.2.3 標(biāo)本的制備 3組7 d齡大鼠分別于制模成功后3 d、7 d、14 d、21 d等4個時間點處死，4%多聚甲醛室溫固定腦組織24 h后，用石蠟包埋，無水酒精脫水，連續(xù)進行皮層、海馬CA1區(qū)冠狀切片，每個時點6 只，每只小鼠切片6張。

1.2.4 Nestin蛋白檢測 采用免疫組織化學(xué)SABC法，按說明書進行操作。腦組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)和自然冷卻后加封閉液，然后加入一抗(BA1289 Nestin)，4℃溫箱過夜(最少16 h)；加二抗生物素化山羊抗兔IgG，37℃溫箱中30 min，用PBS(pH7.3)沖洗，DAB顯色3～5 min，細(xì)胞呈棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.2.5 圖像采集 在Leica BM LB2光學(xué)顯微鏡下觀察切片的陽性細(xì)胞，采用Viewfinder拍照，用MICRO-COSMOS MiVnT 顯微生物圖像分析系統(tǒng)對所采圖像進行圖像分析，統(tǒng)一所有圖像光飽和度、亮度和色調(diào)，并以Image-pro Ilus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值(總光密度除以構(gòu)成被測對象的像素點數(shù))。

2 結(jié)果

表1顯示，Nestin陽性細(xì)胞呈棕黃色，位于胞漿中。陰性對照切片未見Nestin免疫反應(yīng)產(chǎn)物。假手術(shù)組陽性細(xì)胞較少，染色淡。生理鹽水組陽性細(xì)胞數(shù)較同時間點假手術(shù)組增多，且染色深，在NS治療3 d后Nestin陽性細(xì)胞開始增加，7 d達(dá)到高峰，然后表達(dá)減弱，與假手術(shù)組比較，各個時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GbE治療組陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組、NS組均增多，染色深，于治療后7 d表達(dá)達(dá)到高峰，然后表達(dá)逐漸減弱，21 d降到最低，3組在各個時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組新生大鼠海馬Nestin蛋白平均光密度值比較

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05，與生理鹽水組比較：#P<0.01

3 討論

HIBD是圍生期神經(jīng)病學(xué)中的一個重要問題，是新生兒死亡和導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一，嚴(yán)重影響人口素質(zhì)的提高。HIBD后腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死，導(dǎo)致后遺癥的發(fā)生，受損神經(jīng)元的修復(fù)及再生對HIBD的預(yù)后起主要作用。神經(jīng)干細(xì)胞具有多分化潛能，能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等CNS的主要細(xì)胞，并參與神經(jīng)功能的修復(fù)[1]。哺乳動物體內(nèi)存在一定數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞，海馬的DG和SGZ的神經(jīng)發(fā)生能力可保持終身[2]。Nestin蛋白主要用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血、炎癥、腫瘤等病變時，可以誘導(dǎo)Nestin的重新表達(dá)[3-4]，即神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。新生大鼠HIBD后nestin蛋白表達(dá)增加，nestin的表達(dá)可能是神經(jīng)干細(xì)胞增殖的結(jié)果[5]，增殖的神經(jīng)干細(xì)胞進一步分化為神經(jīng)元，對受損的神經(jīng)細(xì)胞起到替代作用，進而促進神經(jīng)功能的恢復(fù)[6]。

目前對HIBD尚無有效的治療方法，急性期以對癥、支持治療為主，后期以康復(fù)治療為主，尋找能減少神經(jīng)元受損和促進神經(jīng)細(xì)胞再生的藥物，可以減少HIBD后遺癥的發(fā)生。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GbE)為銀杏科植物銀杏的干燥葉提取物，其主要有效成分為總黃酮醇和銀杏內(nèi)酯，對機體的作用廣泛，臨床主要用于心腦血管疾病的治療。既往研究表明，GbE可改善心腦血管的缺血再灌注損傷，清除氧自由基，對減少神經(jīng)細(xì)胞損傷、促進腦功能恢復(fù)等方面有很好的作用，近期對臨床患者和志愿者的研究進一步肯定了一定劑量的銀杏葉能夠明顯改善認(rèn)知功能[7-8]。

本實驗從神經(jīng)干細(xì)胞角度研究GbE對HIBD的神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示，HIBD后Nestin的表達(dá)增加，經(jīng)GbE治療后nestin的表達(dá)較NS組明顯增強，治療3 d后開始增加，于用藥7 d時達(dá)到最高峰，然后逐漸下降，表現(xiàn)為Nestin先上升后下降的表達(dá)趨勢。GbE治療新生鼠HIBD后，腦組織Nestin的表達(dá)增加，提示GbE有誘導(dǎo)NESs增殖的作用。而增殖的神經(jīng)干細(xì)胞具體分化為何種神經(jīng)細(xì)胞，本實驗未觀察，可在以后的實驗中明確。

綜上所述，GbE可提高HIBD大鼠腦組織Nestin的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而起到神經(jīng)保護作用。

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