孫 萌，劉 穎，王克林，孫 剛，王笑紅，翟志光，孫佩珠，王 健△

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700； 2.中國中醫(yī)科學院艾滋病防治研究中心，北京 100700)

人類γ δ-T淋巴細胞在外周血中的比例較小，大約占人外周血T淋巴細胞總量的3%左右，且主要表達Vγ2Vδ2 T淋巴細胞受體，75%的該受體基因發(fā)生過Vγ2-Jγ1/2鏈(TCR-)基因重排[1]。γ δ-T淋巴細胞主要分布在機體黏膜局部, 因而被視為機體受到抗原刺激后首先發(fā)生應答的一線防御細胞。由于γ δ-T與α β-T 淋巴細胞比較，具有在感染后能夠更迅速增殖、能調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T淋巴細胞功能、不需要抗原提呈直接識別抗原等能力，因此γδ-T細胞在機體黏膜免疫抗病毒和抗腫瘤方面發(fā)揮著不可忽視的作用[2]。

理論上講，機體未受任何抗原刺激，其γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)基因的重排是隨機的，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，而當其受到腫瘤病毒抗原等相應抗原刺激后，γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)基因譜系會呈現(xiàn)寡克隆優(yōu)勢并出現(xiàn)克隆性改變。目前對HIV感染者γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)多態(tài)性較完整的研究尚少見報道。本研究運用多重引物PCR片段熒光分析技術，對HIV/AIDS患者的γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)進行了基因重排分子測定，為中醫(yī)藥治療免疫系統(tǒng)紊亂和缺陷疾病的療效評價提供一種新的方法手段。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

健康人群來自中國中醫(yī)科學院研究生院學生，陽性被試人群來自北京市地壇醫(yī)院跟蹤隨訪的HIV/AIDS患者，全部由地壇醫(yī)院蛋白印記試驗確認為HIV抗體陽性。HIV/AIDS患者分類按照美國疾病預防控制中心修訂的HIV感染分類與CD4+T 淋巴細胞計數(shù)分期方法，每毫升血液CD4+T淋巴細胞數(shù)小于200為AIDS患者。篩選后確定3組被試人群，其中包括10名健康人，20名HIV感染者以及10名AIDS患者。

1.2 全血DNA提取

清晨采靜脈血外周血2 ml, 將真空采血管內(nèi)血樣混勻，取300 ul抗凝全血，采用Promega 公司的Maxwell 16 Blood DNA Purificanfion Kit自動提取全血DNA系統(tǒng)。檢測蛋白含量符合熒光PCR要求，OD 260/280值在1.8～2.0之間。

1.3 γ δ-T細胞受體TCR-基因熒光PCR 反應

1.3.1 PCR引物 圖1顯示，引物由上海生工生物工程公司合成，TCR-基因重排的檢測需要進行2管PCR擴增試驗，其中TCR-鏈基因重排的檢測PCR引物設計。

圖1 TCR-鏈PCR引物設計示意圖

圖2 健康人群組γδ-T細胞受體(TCR-鏈)基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對應熒光PCR產(chǎn)物的熒光強度

TCR-γ: A管: 正向引物：Vγf1(-178) 5′-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3′； Vγ10(-126) 5′-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3′。 反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX * (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

TCR-γ：B管: 正向引物：Vγ9(-141) 5′-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3′；Vγ11(-58) 5′-CTTCCACTTCCACTTTGAAA-3′。反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX* (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

1.3.2 PCR反應體系和條件 采用Promega的T-Easy PCR 試劑盒，其中 TCR-鏈基因重排總反應體系均為20 ul，分別加入工作反應物，確保20 ul 的PCR反應體系。PCR反應條件為96℃變性 10 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。

1.3.3 上機檢測 采用ABI-3100 基因片斷分析儀進行熒光多重PCR產(chǎn)物的片段分析。熒光PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI-3100 基因片斷分析儀分析，并通過GeneMarker V1.95軟件掃描分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用TCR Assay1.0 定量分析軟件計算正常人個體TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物分別多樣性D值(產(chǎn)物標準差與均值之百分比)，D值可以定量表示TCR多樣性變化以及離散情況。計算健康人群和與HIV/AIDS 患者γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)基因分布的均值、標準差以及與均值比率表示離散距離D(Distance)值。應用Microsoft Excel 2003 (Microsoft) 進行統(tǒng)計分析和作圖；健康人群與HIV/AIDS患者組間離散距離D(Distance)值比較用獨立樣本t檢驗。以CD4+T 淋巴細胞數(shù)是否小于每毫升全血350個為分組標準，將HIV/AIDS患者分為2組進行比較，CD4+T細胞數(shù)與T淋巴細胞TCR-受體基因多樣性變化的相關分析為Pearson 積差相關，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)基因熒光PCR產(chǎn)物掃描分析

圖3 HIV感染者γδ-T細胞受體(TCR-鏈)基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對應熒光PCR產(chǎn)物的熒光強度

圖4 AIDS患者γδ-T細胞TCR-鏈受體基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對應熒光PCR產(chǎn)物的熒光強度

2.2 健康人群與HIV感染者γδ-T細胞受體(TCR-鏈)基因重排多樣性比較

表1顯示，健康人群與HIV感染者比較結果顯示，HIV感染者與AIDS患者的平均D值顯著高于健康人群(P<0.05)，說明健康人群 TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散性較小，更接近正態(tài)分布特征；而HIV感染者與AIDS患者之間，TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度比較差異無統(tǒng)計學意義，說明HIV感染者和AIDS患者組TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物多樣性變化比較大，離散性也比較大。同時以CD4+T 淋巴細胞數(shù)是否小于每毫升全血350個為分組標準，將HIV/AIDS患者分為2組進行比較，盡管2組感染者之間的CD4+T淋巴細胞數(shù)有顯著差異，但2組T淋巴細胞TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度差異無統(tǒng)計學意義，且HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴細胞數(shù)與TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度呈負相關，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細胞受體

(TCR-鏈)基因片斷多樣性比較

表1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細胞受體

A管PCR產(chǎn)物離散度D值(%)B管PCR產(chǎn)物離散度D值(%)健康人群10.5±3.63.8±1.5HIV感染者18.6±4.8*6.6±3.9*AIDS患者21.6±5.3*10.2±3.3*

注：與健康人群比較：*P<0.05

3 討論

近年來，γ δ-T細胞在HIV病毒早期感染中的損傷逐漸得到關注，有數(shù)據(jù)支持γ δ-T細胞可以作為HIV病毒感染及疾病發(fā)展進程的標志免疫細胞[3]。盡管γ δ-T細胞沒有CD4受體，HIV病毒并不直接感染損害γ δ-T細胞，但γ δ-T細胞可以作為HIV病毒感染及疾病發(fā)展進程的標志免疫細胞，γ δ-T細胞對調(diào)節(jié)HIV感染者黏膜免疫感染至關重要。國外研究顯示，為期2年的高效抗病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART) 能夠降低HIV感染者體內(nèi)的病毒載量以及提升CD4+T細胞數(shù)，但并不能有效地恢復γ δ-T細胞的功能和數(shù)量[4]。未經(jīng)HAART治療的長期不進展者(natural viral suppressors，NVSs)體內(nèi)γ δ-T細胞的數(shù)量和功能卻能保持正常的水平[5]。從這個角度來看，直接作用調(diào)節(jié)人體消化道黏膜系統(tǒng)的中草藥，是否對HIV感染者體內(nèi)γ δ-T細胞的功能恢復有所幫助值得研究。

正常人在沒有外來抗原特異性刺激的情況下，機體γ δ-T細胞受體(TCR-鏈)基因片斷處于隨機重排狀態(tài)，形成了γ δ-T細胞受體多克隆性，其TCR-鏈基因片斷掃描圖類似“鐘型”的高斯分布。健康人群γ δ-T細胞受體完整的多樣性可以保障機體具有識別外界多樣性抗原的潛能。若機體免疫系統(tǒng)處于激活狀況，如外界病毒性感染激活和淋巴細胞瘤患者免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)動員激活狀態(tài)，T淋巴細胞受體TCR基因會出現(xiàn)單一化重組表達，其表面標志物受體基因的多樣性出現(xiàn)損害，進而導致其他病原體機會感染的增加[6]。目前針對HIV病毒感染導致γδ-T細胞受體基因多樣性的研究較少。本研究顯示，HIV/AIDS患者體內(nèi)γ δ-T細胞受體TCR-鏈基因呈現(xiàn)單一化重組表達，其表面標志物受體基因的多樣性出現(xiàn)損害。

本研究還比較了不同水平CD4+T 淋巴細胞數(shù)HIV/AIDS患者γδ-T細胞受體基因多樣性情況，發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴細胞數(shù)與其γ δ-T細胞受體基因多樣性之間有一定的相關性。但相關性不顯著，因為本研究只是在一個時間點橫斷面采集被試人群的資料和數(shù)據(jù)，還需要進行長期的縱向跟蹤研究才能得到更加全面的信息數(shù)據(jù)。

目前HIV/AIDS患者免疫系統(tǒng)重建的研究工作逐漸引起重視，但臨床上評價中醫(yī)藥治療HIV/AIDS患者療效及其免疫系統(tǒng)功能的指標仍主要依據(jù)CD4+T 淋巴細胞計數(shù)和病毒載量，存在很大的局限性，也是亟待研究解決的問題之一。因為CD4+T淋巴細胞計數(shù)僅代表CD4+T淋巴細胞的數(shù)量，不能完全反映整體免疫系統(tǒng)的功能，特別是早期HIV感染者黏膜免疫系統(tǒng)的功能。最近的研究表明，黏膜免疫系統(tǒng)在HIV感染以及AIDS病理發(fā)展過程中扮演了重要角色，大多數(shù)HIV感染是通過黏膜傳染的，并且在HIV/AIDS整個感染發(fā)病過程中，感染者的黏膜免疫系統(tǒng)都存在損傷缺陷[7]。廣泛的研究表明，HIV病毒對消化道黏膜免疫系統(tǒng)的破壞、炎性細胞因子以及長期的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，HAART藥物都會使HIV感染者黏膜免疫系統(tǒng)處于激活狀態(tài)[8-9]。

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